用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

我们开发了大规模微流控芯片，以实现多组学分析，旨在阐明轴突损伤后神经元的代谢机制。我们主要利用微流控技术、代谢通量分析和转录组学，推动神经元在轴突损伤与再生过程中的代谢机制研究。我们发现，不同发育阶段的皮层神经元存在代谢差异，且年轻神经元在外伤后会发生代谢重塑。

本方案的核心优势在于其大规模微流控平台的设计与操作标准，能够实现对数百万个细胞进行精确的多组学分析及细胞尺寸测量。首先，将PDMS基质与固化剂转移至离心管中。随后，将装有混合物的离心管放入离心搅拌混合器中。

以 2,000 G 离心 4 分钟，重复两次，以混合并脱气。将 13 至 15 克脱气后的 PDMS 倒入微流控模具中，确保模具底部完全覆盖。随后，将模具放入真空干燥器中，使用真空泵抽真空 5 至 10 分钟，彻底去除 PDMS 中的气泡。

使用橡胶球轻轻敲击PDMS表面，以消除残留的表面气泡。将模具转移至对流烘箱中，在80摄氏度下烘烤100分钟，以固化聚二甲基硅氧烷。待PDMS完全固化后，将手术刀刀尖轻轻插入PDMS边缘下方，小心抬起并将其从模具上分离。

使用直径为 2.0 至 2.5 毫米的活检打孔器，在 PDMS 上打孔，用于培养基灌注和细胞加载。用胶带去除 PDMS 表面的任何杂质，然后将其放入洁净的玻璃培养皿中，并用铝箔包裹以储存。实验前，将微流控装置在 121 摄氏度和 101 千帕条件下高压灭菌 5 分钟，以确保无菌。

将适用于传统微流控装置的盖玻片放入35毫米的培养皿中。向培养皿中加入2毫升浓度为0.1毫克/毫升的聚-D-赖氨酸溶液。在37摄氏度下孵育培养皿6小时或过夜。

孵育后，小心取出聚-D-赖氨酸溶液，以备重复使用或进行妥善处理。随后，向培养皿中加入 2 mL 无菌超纯水，顺时针旋转 50 次，再逆时针旋转 50 次。

使用连接无菌移液器吸头的真空泵吸取液体，并将废液收集至液体废液容器中。所有洗涤步骤完成后，将盖玻片置于生物安全柜中自然晾干后再使用。用无菌细尖镊子将经高压灭菌的微流控芯片放置在玻璃表面中央，微通道面朝下。

使用200微升移液枪头轻轻按压芯片，使其完全贴附于玻璃表面。接着，用永久性记号笔在左侧腔室上标记一个点，以标识胞体区。用10微升移液枪吸取10微升神经元悬液，然后缓慢将悬液加入已标记的胞体区上方的加样孔中。

确认液体正确流入左侧室的下部储液区。将培养皿转移至设定为37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育20分钟。孵育后，将培养皿置于20倍显微镜下，通过微通道确认培养基从胞体区充分流入轴突区。

现在，用移液器将150微升神经元基础培养基加入轴突室的上端口。同样，将150微升完全神经元培养基加入胞体室的上端口。接下来，将20毫升超纯水倒入150毫米的培养皿中，以创建一个湿度 chamber。

将35毫米培养皿放入大培养皿内，然后将整个培养系统转移至培养箱中，并维持所需的时间。使用直径10厘米的培养皿放置大规模微流控装置。根据实验需求选择全通道或间隔通道接种方式，因为每种方法需要不同的轴突损伤实验方案。

接种完成后，向培养皿中加入 5 毫升完全神经元培养基，以维持神经元生长。将适量神经元基础培养基转移至新的 15 毫升离心管中，备用。将含有皮层神经元的微流控装置置于洁净台中。

使用无绒纸擦干 35 毫米培养皿的底部，然后用 200 微升移液器吸取微流控装置右侧两个孔中的培养基。接着，将真空泵管路连接至一个无菌、无滤膜的 200 微升移液器吸头。打开真空泵，设置抽吸速率为 60 升每分钟，将吸头对准轴突末端室下方孔与腔室之间的连接处，以吸取旧培养基，利用负压导致轴突断裂。

更换移液枪头，吸取 150 微升神经元基础培养基，通过右侧腔室的下孔缓慢加入。完成加样和抽吸操作四次后，更换为新鲜的完全神经元培养基，然后从胞体侧孔中抽吸旧培养基，根据需要加入含有药物的新鲜完全神经元培养基。将微流控装置与培养皿一同放入 150 毫米的培养皿中，继续培养所需时间，例如 24 小时。

进行手动轴突损伤时，将神经元接种至大规模微流控装置的所有腔室中。将装置置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，37摄氏度孵育三天。体外培养第七天，从培养箱中取出含有微流控装置的培养皿，放置于无菌载台之上。

使用20倍放大倍数的显微镜，并用75%乙醇对工作区域进行消毒。手持10微升无菌滤芯吸头，在显微镜引导下识别原始微通道中的轴突束。利用吸头沿每束轴突进行纵向划痕。

在显微镜下实时观察轴突断裂情况。标准微流控装置中的微通道允许轴突生长，但不允许胞体通过，这一点已通过体外培养7天后的βIII微管蛋白染色结果证实。轴突损伤后，神经元密度未显示显著差异，表明未观察到明显的神经元死亡。

开发了一种具有三维可扩展设计的大规模微流控装置，用于多组学分析。未打孔和已打孔的PDMS复制品均能牢固地粘附在10厘米培养皿或PC板上。通过移液枪头刮擦诱导的轴突损伤导致轴突明显断裂且形态破坏，与损伤前完整的轴突形成对比。

在损伤后6小时和24小时均观察到轴突再生，而未损伤的轴突保持稳定。神经元蛋白浓度从基线水平的1420.4微克/毫升显著上升至损伤后6小时的1748.9微克/毫升，以及损伤后24小时的1823.7微克/毫升。对照组与轴突损伤组的RNA得率几乎相同。

RNA测序鉴定出595个损伤特异性基因和609个对照特异性基因，两组间共有17,471个共享基因。KEGG通路分析显示，损伤后氧化磷酸化、活性氧应答、自噬以及三羧酸循环通路显著上调。