用于解读菌根异养植物组织中真菌定植及种子共生萌发的显微技术

该方案介绍了多种显微技术，用于研究菌根异养植物中的真菌定植过程，详细涵盖了从样品采集到制备的关键步骤。这些技术可广泛应用于各类菌根异养植物，甚至可用于非菌根异养植物的其他植物材料。本方法主要与植物结构学相关，同时也可为菌根互作、生理学、繁殖生物学、进化及菌根异养植物的生态学研究提供重要信息。

首先，通过探查植物基部周围的土壤来采集菌根异养植物，注意不要损伤地下器官。同时，避免将植物从土壤中拔出，以防地上部分与地下部分分离。使用园艺铲小心地在地面以上结构周围挖掘，同时探查根、茎、根状茎和贮藏器官等地下结构，且不损坏这些组织。

去除土壤颗粒以保护脆弱结构，并用自来水小心冲洗这些器官，以洗去残留的土壤颗粒，然后再固定样品。与枯枝落叶相关的菌根异养植物需要格外注意。因此，应仔细采集通过菌丝与腐烂物质相连的 delicate 器官，避免将其从连接结构中拉出。

保留具有此类连接的结构，并收集凋落物以供分析。用于透射电子显微镜分析时，将3至4毫米厚的样品在戊二醛-二甲胂酸钠缓冲液液滴内切成1至2毫米厚的较小片段。丢弃液滴外的切边部分。

在采集植物后，立即在采集地点进行固定处理。立即将样品转移至收集管中，所加固定剂的体积应超过样品体积的10倍以上，因为该固定剂为添加型固定剂。用于对器官表面菌丝的分析，特别是地下器官及与枯枝落叶接触的器官。

在解剖显微镜下以7.5倍或更高放大倍数观察新鲜或固定的材料。根据表面菌丝和根状菌索的分布，寻找目标区域。选择含有表面根状菌索的样品，因为这些样品可进行切片，以观察根和茎皮层细胞内的菌丝团（pelotons）和菌丝圈（hyphae coils）。

按照文稿中所述方法，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液配制0.2毫克/毫升的小麦胚芽凝集素荧光素偶联物溶液和1% Calcofluor White溶液。然后，将载玻片上的切片用小麦胚芽凝集素荧光素偶联物溶液完全覆盖，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤切片，并将切片置于Calcofluor White溶液中作为封片介质进行孵育。

接下来，将盖玻片置于载玻片上，并使用指定的滤光片在共聚焦或荧光显微镜下进行观察。固定样品后，进行脱水处理，并将其保存在70%乙醇中，然后使用锋利且全新的剃须刀片以单向移动的方式切割，暴露任意需要的表面，用于扫描电子显微镜分析。如有必要，可使用体视显微镜挑选样品，并在确定样品尺寸时考虑金属样品台的面积。

此外，使用乙醇系列对样品进行脱水处理。小而精细的样品在每个浓度中维持30分钟，较大且较致密的样品则维持1小时。接下来，使用滤纸折叠成小信封，以在后续步骤中对样品进行有序整理。

较大的样本可无需使用信封。使用铅笔标记信封，并对样本进行记录。使用画笔小心地将样本放入信封内。

现在，将这些样品置于无水乙醇中。立即按照标准操作程序运行临界点干燥仪进行临界点干燥。具体操作为：将样品置于无水乙醇中，放入样品托架，然后将其置于临界点干燥仪的压力腔内。

在临界二氧化碳点，中间液体溶解于过渡液体中，从而实现样品的干燥。由于样品可能因重新吸收空气中的湿气而遭到破坏，因此在临界点干燥后应立即将其存放在干燥容器中。在将样品装载到金属载片上之前，需戴上手套以操作载片。

将它们浸入丙酮中5分钟以去除任何脂肪，并使其干燥。在体视显微镜下，使用导电双面碳胶带将样品固定在样品台上并进行定位。在扫描电子显微镜图像中，仅能从上方观察该位置。

操作样品时，请使用尖头镊子。镊子接触的样品部位通常会受损，因此需小心操作，尽量夹取远离感兴趣区域的部位。

将带有样品的载片置于含有硅胶的密封培养皿中保存。随后，按照标准操作程序进行溅射镀膜，在惰性气体的低压环境中于样品表面沉积一层金或铂，镀层厚度取决于样品的表面形貌，通常在15至40纳米之间。

最后，将包被的载片置于含有硅胶以保持湿度的密封培养皿中保存。样品可按此方法保存数周。使用扫描电子显微镜分析这些样品。

在扫描电子显微镜观察过程中，电子束会轰击真空中的样品，由此相互作用产生的信号被解析为图像。在种子共生萌发过程中，应确保所用溶液和材料均处于无菌状态，以避免污染。

首先在121摄氏度下高压灭菌20分钟。在超净工作台中，将果实和种子浸入含2%有效氯的次氯酸钠溶液中，进行表面消毒。细小而脆弱的种子可浸入稀释1:1的次氯酸钠溶液中。

消毒后，使用擦镜纸过滤回收种子。用高压灭菌的蒸馏水将果实和种子清洗三次，以去除次氯酸盐溶液，然后进行发芽试验。如有必要，将种子存放在装有硅胶的玻璃瓶内的滤纸信封中，于 4 摄氏度下密封瓶口，并用保鲜膜封口；随后，取最后一次清洗的少量水滴转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基，以评估清洗过程的有效性。

对于兰花种子的共生萌发，将种子置于含有燕麦琼脂培养基的培养皿中，其上放置1至2厘米大小的已灭菌滤纸片，并在其中孵育。随后，将含有选定分离真菌菌丝的培养基碎片接种到培养皿中央。用保鲜膜密封培养皿，并在黑暗条件下于约25摄氏度或室温下孵育，具体温度根据真菌生长情况而定。

准备一些含有种子但未接种真菌的培养皿，作为萌发试验的阴性对照。通过收集原球茎和幼苗的定量与定性数据，并拍照记录，每周分析一次萌发结果。菌索通常呈深色、鞋带状结构，易于识别。

徒手切片或其他获得厚度超过10微米切片的方法能更清晰地显示菌丝团（pelotons），并提供更具代表性的真菌定植模式图像。徒手切片也可适用于高倍放大下的菌丝分析。然而，更细微的结构细节在较薄切片中观察效果更佳。

木质部细胞中的次生细胞壁可通过甲苯胺所呈现的浅色轻松识别。与此同时，仅由初生细胞壁构成的韧皮部细胞则因其较薄且颜色较深的细胞壁而被识别。在乙二醇甲基丙烯酸酯树脂切片中可观察到自体荧光产生的伪影。

这些伪影通常与荧光染料浓度有关，可通过用缓冲液增加样本洗涤次数来避免。根部的徒手切片显示了内部和外部的菌丝。通过扫描电子显微镜可观察到同一器官表面存在大量根状菌索和单个菌丝。

大多数兰科植物在接种真菌感染后数周内开始萌发，有时甚至需要超过一个月的时间。扫描电子显微镜可用于观察花、果实和种子，以研究繁殖生物学或菌根异养植物。种子的共生萌发也可在自养型兰科植物中进行测试。