使用 ImageJ 对免疫组织化学处理组织的显微照片进行小胶质细胞形态定量分析

这些骨架分析和分形分析方法的总体目标是利用高通量且对细胞形态微小差异敏感的定量方法，从免疫组织化学制备的组织中测量小胶质细胞的形态。该方法有助于通过定义小胶质细胞在健康与疾病状态下的形态与功能细微变化，回答神经炎症领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它采用连续变量而非分类变量来量化小胶质细胞的形态特征。

此处描述的方法无需使用专有软件，可用于脑区筛选或单细胞分析。演示该实验步骤的是本实验室的技术员 Kimberly Young。开始之前，请确保已将 AnalyzeSkeleton 插件下载至 ImageJ 或 Fiji 中。

然后打开一个显示 Iba1 免疫染色脑组织的 30 微米 Z 轴层叠图像。如果使用荧光显微照片，请确保图像为 8 位，并转换为灰度模式，以最佳显示所有阳性染色信号。使用工具栏，点击图像（Image），查找表（Lookup Tables），灰度（Grays）。

若使用 DAB 明场显微照片，首先使用默认设置应用 FFT 带通滤波插件。依次点击“Process”（处理）、“FFT”（快速傅里叶变换）、“Bandpass Filter”（带通滤波），然后将图像转换为灰度模式。如果图像过暗导致小胶质细胞形态难以观察，可使用工具栏并点击“Image”（图像）、“Adjust”（调整）、“Brightness/Contrast”（亮度/对比度）进行调节。

根据需要调整最小值或最大值滑块，可调整至直方图的边缘，但不得超过边缘。调整亮度会对数据分析产生最大的变异性，因此是最关键的步骤。接下来，运行“非锐化掩模”滤镜以进一步增强对比度，方法是单击“Process”（处理）、“Filters”（滤镜）、“Unsharp Mask”（非锐化掩模）。

执行去斑点处理以去除由非锐化掩模产生的椒盐噪声。使用工具栏，依次点击“Process”（处理）、“Noise”（噪声）、“Despeckle”（去斑点）。通过选择“Image”（图像）、“Adjust”（调整）、“Threshold”（阈值）将图像转换为二值图像。

然后对二值图像应用去斑点（Despeckle）功能，以去除任何残留的单像素噪声。接着，通过点击“Process”（处理）、“Binary”（二值化）、“Close”（闭合），应用闭合功能，连接被最多两个像素分隔的暗像素。接下来，通过点击“Process”（处理）、“Noise”（噪声）、“Remove Outliers”（去除异常值）来去除异常点。

将图像另存为单独文件以供将来使用后，使用工具栏对图像进行骨架化处理：依次点击 Process（处理）、Binary（二值化）、Skeletonize（骨架化）。选择骨架化后的图像，然后运行 AnalyzeSkeleton 插件：依次点击 Plugins（插件）、Skeleton（骨架）、Analyze Skeleton（分析骨架），并勾选分支信息框。复制结果窗口和分支信息输出的数据，并将数据粘贴到 Excel 电子表格中。

在 Excel 中裁剪数据，以去除由免疫组化和图像采集产生的骨架片段。通过在 ImageJ 中打开骨架化图像并选择线段工具，确定将从数据集中裁剪掉的片段长度。测量多个片段，记录其平均长度，并确定一个截断值，该值应在整个数据集中保持一致。

通过点击“排序和筛选”中的“自定义排序”来对 Excel 电子表格进行自定义排序。首先按终点体素数从大到小排序，然后在第二级排序中按 Mx 分支 PT 从大到小排序。删除所有包含两个终点且最大分支长度小于截断值的行。

将终点列中的数据相加，以计算从图像中收集到的终点总数。按分支长度排序后，对分支信息数据进行相同操作。在完成所有数据的截取和求和后，将每幅图像的数据除以相应图像中小胶质细胞胞体的数量。

将最终的终点、细胞数量以及每个细胞的分支长度数据输入统计软件。确保已下载 FracLac 插件。然后使用矩形工具绘制感兴趣区域（ROI）。

确保选框足够大以包含整个细胞，并且在整个数据集中保持一致。在“感兴趣区域（ROI）管理器”窗口中，选择“更新”以将感兴趣区域锁定在显微照片中随机选择的一个细胞上。打开包含所选细胞的二值图像。

双击画笔工具，将颜色设置为黑色，并根据需要调整画笔宽度。以对应的显微照片作为参考，使用画笔工具去除相邻细胞的突起，连接断裂的突起，并分离出目标细胞。完成二值化细胞的分离后，保存二值化文件。

使用工具栏中的“Process（处理）”→“Binary（二值化）”→“Outline（轮廓）”功能，将二值化细胞转换为轮廓图像。在工具栏中，通过点击“Plugins（插件）”→“Fractal Analysis（分形分析）”→“FracLac”打开FracLac插件，并选择用于盒计数的BC选项。在“Grid Design（网格设计）”中，将Num G设置为4。

在图形选项中，勾选度量框以分析细胞的凸包和边界圆。完成后，选择“确定”，然后选择“扫描”按钮，对选定的图像执行盒计数扫描。在凸包和圆结果窗口中，复制所有所需的数据结果。

然后在 Box Count 汇总窗口中执行相同操作。将复制的数据转移至 Excel 文件或统计软件中。该图展示了未损伤和损伤皮质组织中每个细胞的小胶质细胞终点数和每个细胞的突起总长度的汇总数据。

这是应用该方案进行分析的结果。在两种情况下，均使用学生t检验进行统计学分析，并分析了三幅图像。在应用该方案时，需注意不同操作者之间可能存在的变异性。

这些差异在此处进行了总结，其中同一数据集由两名独立操作人员采用相同的实验方案进行分析。尽管整体趋势相似，但操作者之间的变异性会影响数据的显著性。在进行该操作时，需牢记目标是获得一个能够代表原始显微照片的骨架或轮廓模型。

这意味着这些步骤可根据研究者的具体需求进行调整。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用 readily available 的计算机软件，从免疫组织化学组织的显微照片中快速定量小胶质细胞形态。