光片显微镜用于人免疫细胞的三维可视化

该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如免疫细胞在生理相关环境中的具体行为，以及如何在三维环境中高效搜寻靶细胞。该方法的主要优势在于能够生成一束极薄的光，仅照射焦平面，而不影响焦平面外的细胞。这使得成像速度显著加快，同时大幅减少光漂白和光细胞毒性。

本实验操作将由我实验室的博士后赵Renping博士演示。首先，在细胞培养超净台内，将400微升冰冷的胶原蛋白储备液转移至无菌的1.5毫升离心管中。然后缓慢加入50微升冰冷的10倍浓度磷酸盐缓冲液（10X PBS）。

然后通过轻轻倾斜试管来混匀溶液。向胶原溶液中加入 48 微升 0.1 摩尔的氢氧化钠，以将 pH 值调节至 7.2 至 7.6。使用 pH 试纸测定混合液的 pH 值。

加入两微升无菌去离子蒸馏水，使终体积达到500微升。充分混匀后将胶原蛋白溶液置于冰上或4摄氏度保存，以备后续使用。根据文本方案对活细胞进行荧光标记后，在细胞培养罩内，将1×10⁶个细胞转移至无菌的1.5毫升离心管中。

将离心管在200 × g条件下离心8分钟。然后弃去上清液，加入200 µL培养基重悬沉淀。向细胞悬液中加入85.9 µL中和的胶原蛋白溶液，充分混匀，使胶原蛋白终浓度为2.5 mg/mL。

将细胞胶原混合物置于生物安全柜中的冰上。接着，将推杆插入匹配的毛细管中，直至推杆从毛细管末端伸出1毫米。然后将推杆浸入培养基中以润湿。

跳过此步骤可能导致柱塞与胶原基质之间意外引入气泡。将毛细管插入细胞-胶原混合液中，缓慢回拉柱塞10至20毫米。然后用装有70%乙醇的喷雾瓶将纸巾润湿，用其擦拭毛细管外壁，以去除残留的胶原溶液。

现在使用建模黏土将毛细管固定在5毫升离心管的内壁上。将细胞-胶原混合物推至毛细管边缘。然后将带有毛细管的离心管置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育1小时，以使胶原聚合。

孵育结束后，向试管中加入一到两毫升培养基。然后小心地将聚合的胶原蛋白凝胶柱排出至培养基中，使约一半的胶原蛋白悬于培养基内。再将毛细管孵育30分钟。

进行光片显微镜成像时，按照制造商的说明组装样品室。若进行活体成像，先打开显微镜和培养箱，然后将毛细管放入样品室中，定位样品并找到用于图像采集的兴趣区域。激活相应的激光器。

然后设置激光功率和曝光时间。同时设置Z轴扫描的步进大小、Z轴扫描的起始和终止位置，以及活细胞成像的时间间隔。然后开始图像采集。

在化学通风橱中，将1毫升4%多聚甲醛PBS溶液转移至一个5毫升离心管中。然后将含有聚合胶原的毛细管浸入多聚甲醛溶液中，并使用模型黏土将毛细管固定在管内壁上。轻轻按压推杆，直至一半的胶原柱悬垂于多聚甲醛溶液中。

然后回拉活塞，将胶原棒重新吸入毛细管中。将毛细管从管中取出，弃去多聚甲醛。将毛细管装入新的离心管中，并加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。

确保毛细管浸没在 PBS 中。轻轻按压柱塞，使胶原蛋白棒的一半悬于溶液中，孵育五分钟。回拉柱塞，将胶原蛋白棒吸入毛细管内。

然后用新鲜的 PBS 替换原有的 PBS，并将胶原蛋白棒排入溶液中。第三次洗涤后，向试管中加入一到两毫升封闭透化缓冲液。将胶原蛋白棒排入溶液，并在室温下孵育 30 至 60 分钟。

用 200 至 500 微升含一抗的封闭透化缓冲液替换原有的封闭透化缓冲液，将浸没的胶原蛋白棒置于该溶液中孵育一小时。用 PBST 将胶原蛋白棒洗涤三次后，将其在含二抗的封闭透化缓冲液中室温孵育一小时。再用 PBS 洗涤三次后，将胶原蛋白棒重新拉回毛细管中，并将样品保存在 PBS 中直至成像。

如本视频所示，在迁移过程中，转染了EGFP-肌动蛋白融合蛋白的CTL细胞形成了柠檬形的主要突起，边缘伴有细长的纺锤状结构。此处用速度和持续性（即位移除以总轨迹长度）作为测量参数来描述CTL细胞的运动轨迹。速度范围为0.01至0.19微米/秒，差异近20倍；持续性范围为0至0.7。

该图显示了在三维胶原凝胶中固定的CTL细胞，对内源性穿孔素-1和肌动蛋白进行染色。样品从单侧或双侧进行照明。从不同的Z轴位置观察，细胞染色均匀，表明抗体对胶原凝胶具有良好的穿透性。

固定后的CTL细胞表现出与活细胞相同的形态，表明该实验方案能很好地维持细胞形态。在进行此操作时，必须注意避免产生气泡，并正确调节pH值。在完成本步骤后，可进一步采用其他方法，例如使用特定表面分子对活细胞进行染色，以探讨更多科学问题，如细胞行为与分化过程或不同细胞亚群之间的关联，或用于研究细胞间相互作用及细胞命运。

该技术问世后，为细胞生物学、免疫学和癌症研究领域的研究人员探索细胞行为、细胞命运、分化以及细胞间相互作用提供了最接近生理条件的体外实验体系。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备包埋于三维胶原基质中的细胞样本，如何利用光片显微镜对活体或固定样本进行成像，以及如何在三维环境中追踪细胞迁移过程。