基于三维定量相位成像与机器学习的无标记淋巴细胞亚型识别

该方法为传统的荧光标记和流式细胞术分析流程提供了一种替代方案，后者耗时较长、成本较高，且存在改变样本细胞功能的风险。该技术的主要优势在于，三维折射率断层成像与机器学习均为无需标记且可定量的方法，能够实现快速而准确的淋巴细胞识别。该技术的应用前景涵盖血液系统肿瘤和自身免疫性疾病的治疗，因为淋巴细胞的识别对于疾病诊断和合理治疗方案的制定至关重要。

尽管该方法可用于分析淋巴细胞群体，但也适用于其他目标单细胞（包括细菌）的分析。三维定量相位成像技术的可视化演示至关重要，因为它有助于清晰地指导该技术的操作流程，并有助于理解其应用。首先通过荧光激活细胞分选法收集每一种淋巴细胞亚群。

为获得最佳成像效果，将每份细胞样品用RPMI培养基稀释至浓度为每微升180个细胞，并缓慢注入120微升第一份稀释后的样品至成像室中。确认成像室内无气泡后，在3D定量相位显微镜的物镜上滴加一滴蒸馏水，然后将成像室放置于显微镜的移动载物台上。调节载物台，使样品与物镜对齐，随后在成像软件的显微镜视角校准选项卡中，分别点击“聚焦”和“表面”，以调节物镜和聚光镜的轴向位置。

单击自动模式以校准物镜和聚光镜。为优化校准效果，打开扫描模式，并手动调节镜头，使数字微镜器件图案与中心对齐。然后返回正常模式，调节平移台以在视野中定位一个细胞。

调整物镜的轴向位置以找到焦平面，直至屏幕上显示的样品边界几乎不可见。准确对细胞进行聚焦对于生成最佳的三维折射率断层图像至关重要。如果图像采集不当，三维重建将受到影响，导致断层图像出现噪声。

调节平移台以找到一个无细胞的位置，然后单击“校准”以在不同照明角度下测量多个二维全息图。调节平移台，使细胞位于视场中心。在“采集”选项卡下，为正在成像的样本命名。

单击“3D 快照”以使用与刚刚测量的 2D 全息图相同的照明角度来测量细胞的全息图。当采集的数据出现在“数据管理”面板中时，右键单击该数据，然后单击“处理”，以利用成像软件中实现的衍射断层成像算法，从 2D 全息图重建 3D 折射率断层图像。成像完成后，在“数据管理”面板中右键单击数据，然后单击“打开”以可视化数据。

单击细胞中心以重新定位，并在数据管理器面板中单击RI断层图像。在预设选项卡中，单击加载，然后双击淋巴细胞.xml，这是成像软件提供的预定义传递函数，用于根据三维RI分布可视化断层图像。

滚动鼠标以放大，拖动细胞可向任意方向旋转。为进行定量的形态学和生物化学特征提取，请将所有断层扫描数据放入一个单独的文件夹中，并在主文件夹内将不同类型的细胞分别置于各自的子文件夹中。接着，在适当的成像软件中打开辅助特征提取文件，并编辑第14行，指定要从中提取数据的断层扫描图像文件夹。

编辑第15行，指定提取的特征数据将要保存的文件夹，然后执行代码。对于数据集中的每个断层图像，该代码将计算表面积、细胞体积、球形度、蛋白质密度以及每个折射率阈值下的干质量。对于监督学习与识别，使用MATLAB中的简单随机分割算法，将提取的特征数据随机划分为独立的训练集和测试集文件夹。

打开补充训练文件，编辑第14行以指定训练集文件夹，第16行以指定保存训练后分类器的文件夹，第17行设置分类器的文件名。然后执行代码。代码将使用训练集的选定特征，通过K近邻算法训练分类器，并将训练好的分类器保存到指定文件夹中。

接着，打开补充测试文件三，编辑第14至15行以指定待测试的已训练分类器，并编辑第17行以指定已训练的测试数据集。然后执行代码。该分类器将识别测试集中各个淋巴细胞的细胞类型。

此处展示了B淋巴细胞、CD4阳性T淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的代表性三维折射率断层图像，图像采用不同配色方案，颜色根据成像软件赋予的折射率值进行分配。通过折射率值可计算出定量的形态学和生物化学特征。在本实验中，T淋巴细胞和B淋巴细胞分类的准确率在训练样本中为93.15%，在测试样本中为89.81%。

对CD4阳性与CD8阳性T淋巴细胞进行了统计学分类，在训练集和测试集上的准确率分别为87.41%和84.38%。最后，多类别细胞类型分类器在训练和测试阶段的准确率分别为80.65%和75.93%。图像的质量和数量对该技术的成功至关重要。

图像质量越高，数据量越大，识别的准确性就越高。深度学习可用于更全面地分析体层扫描图像的复杂数据，从而显著提升识别性能。此外，荧光成像和三维定量相位成像可用于研究已识别淋巴细胞的生理功能路径。

该技术问世后，为细胞生物学和生物医学领域的研究人员探索不同生物体内的特定疾病提供了新的途径。事实上，免疫学家尤其可以利用这一新技术来鉴定目标细胞群体。