人脐静脉脱细胞与再细胞化方法

本方法详细阐述了隐静脉组织工程的操作流程。我们还展示了如何使用简单的设备制备脱细胞装置以及用于再细胞化的生物反应器。该技术的主要优势在于再细胞化仅需少量血液样本，从而避免了痛苦的骨髓采集过程以及耗时的细胞培养步骤。

对于Triton-X 100的灌注和洗涤，准备去细胞化装置一。将三段A管用胶带固定在一个两升的容器内。将其中一段管子固定在容器壁上，使其边缘接触容器底部，作为去垢剂的入口。将另外两段管子固定在相对的容器壁上，彼此间距为5至10厘米，具体距离取决于静脉的长度。

这些管子至少应有五厘米用胶带固定在腔室的底部。使用公母接头将洗涤剂的进液管连接到管 B。然后将管 B 连接到管 F，再将管 F 连接到管 C。最后将管 C 连接到静脉进液口。

现在，将 F 管放入蠕动泵的卡槽中。取另一根 C 管，将其一端连接到静脉的出口，另一端放入一个带有底部软管出口且置于腔室上方 45 厘米处的玻璃罐中，并用胶带固定。

这用作洗涤剂出口。然后，将管 G 的一端插入玻璃罐软管出口，另一端放入静脉腔。接下来，按照文本方案中的说明，准备用于 TnBP 灌注的脱细胞装置二。

同时按照文中所述准备用于DNA灌注的去细胞化装置三，并置于37摄氏度环境中。为准备再细胞化生物反应器，将管H插入四口盖的一个接口中，作为静脉出口；将管I插入第二个接口中，作为培养基入口。

将管 J 插入第三个端口，作为静脉的入口。接下来，将管 H 的另一端插入第四个端口，作为培养基的出口。将减径接头连接至管 H 和管 J 的内端。将管 J 的另一端弯成 U 形，并用缝合线扎紧。

现在，将一个带有平底的60毫升离心管放入250毫升的玻璃杯中。接着，将一根K管的一端连接到静脉入口，另一端连接到E管。将E管再连接到第二根K管，然后连接至培养基入口。随后，将准备好的帽组件放入瓶中的离心管内。

最后，通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。在剪取一段长度为两毫米的活检组织前，按照文本方案中所述，对人隐静脉进行两次冻融循环处理。将活检组织在室温下用甲醛固定24至48小时。

用缝线将静脉的每一端分别系在公母引线连接器的倒钩上。将静脉连接至脱细胞装置一，并向腔室内加入一升溶液二。随后，在35毫升/分钟的流速下灌注15分钟，然后排空装置中的内容物。

然后，加入一升溶液四，以每分钟35毫升的速度灌注四小时。倒空内容物，加入500毫升溶液二，灌注五分钟，再次倒空内容物。将静脉从灌注装置一上断开，并连接至灌注装置二。

接下来，加入一升溶液五，开启搅拌器，并以每分钟35毫升的流速灌注四小时。将静脉从灌注装置二上断开，用20毫升超纯水冲洗静脉外壁两次。然后使用注射器用20毫升超纯水冲洗静脉内壁两次，每次持续五到十分钟。

按照文本方案中所述使用灌注装置三进行灌注后，将静脉连接至灌注装置一。加入一升溶液二，以每分钟35毫升的速度过夜灌注。重复灌注过程四次，以彻底清除核物质。

灌注完成后，排空装置，加入一升溶液二，并以每分钟35毫升的速度持续灌注24小时。24小时后，再次排空装置，加入一升超纯水，以每分钟35毫升的速度继续灌注24小时。

最后，在相同条件下重复灌注，但使用溶液七。按照文本方案中所述验证脱细胞效果后，将静脉置于含有50毫升溶液八的50毫升离心管中进行灭菌处理。在37摄氏度下，以每分钟80转的速度在摇床中振荡一小时。

在超净工作台中操作以保持无菌状态，现在使用无菌镊子将无菌血管转移至一个新的50毫升离心管中，管内含有50毫升无菌溶液七，其中包含500微升抗抗。如前所述振荡血管12小时，期间至少更换两次溶液七。使用无菌镊子将血管转移至另一个新的50毫升离心管中，加入50毫升内皮细胞培养基，并振荡11小时。

现在，使用无菌缝合线和镊子将血管连接到生物反应器的血管入口和出口，并将瓶盖组件拧紧至250毫升瓶上。用相同的内皮细胞培养基填充生物反应器。加入肝素至终浓度为每毫升50单位，在培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注一小时。

在肝素涂层的真空采血管中采集供体15至25毫升新鲜血液，并用Steen溶液以1:1比例稀释。随后，加入内分泌腺来源的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及微量水杨酸。将生物反应器中的内皮培养基移除后，将血液加入其中，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注48小时。

约12小时后，在超净工作台中操作，从生物反应器中取出一滴血液，使用血糖监测仪测量葡萄糖浓度。如果浓度低于3毫摩尔/升，则添加葡萄糖，使其浓度升至7至9毫摩尔/升范围内。重新放入培养箱中48小时后，在超净工作台中将生物反应器中的血液排出。

加入30毫升无菌溶液七，灌注5分钟，然后排出溶液。重复此步骤直至血液的红色消失。最后，加入30至45毫升内皮细胞培养基，在培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注96小时。

在超净工作台中将再细胞化的静脉从生物反应器上断开，用剪刀剪去静脉两端各5毫米的边缘并弃去。按照之前的方法取活检样本，置于甲醛中，并按照文本方案所述进行再细胞化验证。正常静脉的大体形态呈鲜红色。

随着脱细胞处理循环次数的增加，红色逐渐消失，经过五次处理循环后，血管呈现苍白白色。通过外周血和内皮培养基灌注重新接种细胞的静脉再次呈现鲜红色。图中显示的是正常静脉的代表性苏木精-伊红染色图像，可见大量蓝色细胞核。

然而，在脱细胞静脉的苏木精和伊红染色中未观察到蓝色的细胞核。在用血液和内皮培养基灌注的再细胞化静脉中，苏木精和伊红染色显示管腔内存在细胞黏附。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用去污剂对大隐静脉进行脱细胞处理，以及如何使用外周血和内皮培养基进行再细胞化。

采用Triton-X 100、TnBP和DNA在压力下灌注进行脱细胞的技术，成功且可重复地去除了人隐静脉中的细胞核。尽管该技术需要20天才能完成，但将脱细胞静脉作为即用型产品储存后，可将操作时间缩短至8天。使用受体外周血对静脉进行再细胞化可能具有临床相关性。

采用类似方案重新细胞化的静脉在临床移植中展现出良好前景，术后可提供功能性血液供应。经过轻微修改，该方案可适用于任何类型的静脉，并可作为个性化移植物用于所有血管外科手术的临床应用。