整合成像流式细胞术与转录组学分析以评估内吞性CD1d运输的改变

这些方法结合了高通量测序与流式细胞术成像分析，有助于回答一些有趣的问题，例如在污染物暴露环境中，某些表型改变是否与转录组无关。对我们而言，这种简单方法的主要优势在于，可用于检测具有重要生物学功能的蛋白质的共定位，从而在功能层面上解释关键差异表达基因的结果。

该技术的应用前景涉及病理学和毒理学结果的诊断。作为一种常规成像方法，foresee 能够将基因表达与蛋白质功能关联起来。通常，初学者由于成像和转录组分析较高的技术要求，会在该方法的应用上遇到困难。

为了对人单核细胞来源的树突状细胞文库进行测序，首先将测序试剂和索引试剂分别加入测序生物合成试剂架和索引试剂架中，并将试剂架置于实验室级水浴中孵育一小时，直至冰完全融化且试剂充分混匀。在试剂解冻的同时，启动测序仪，当出现“请勿弹出”驱动器时，将计算机连接至网络驱动器，并打开测序仪控制软件。随后，向测序生物合成试剂架中的每个瓶子加入约 100 毫升维护清洗液，并为每个瓶子拧上漏斗盖。

向索引试剂架中的每个 15 毫升锥形管中加入约 12 毫升维护清洗液，并丢弃管盖。然后将两个架子装入测序仪中。在测 序仪控制软件中选择“维护清洗”，并按照提示操作以清洗测序仪流体系统。

使用手电筒目视检查流动池中是否有气泡流过通道，以确保无泄漏。洗涤程序完成后，打开“测序”选项卡，启动新测序运行，并将输出数据指向网络驱动器。上传用于解复用的样本表单，并输入相应的试剂信息。

使用已用过的流动池，配合测序试剂对系统进行引液。簇生成完成后，取下流动池，并用清水轻轻喷洒细胞表面。

用镜头纸将流动池擦干，随后轻轻喷洒95%乙醇。再次将流动池擦干后，在光线下检查其表面，确保清洁，无碎屑或盐残留。完成预启动步骤后，加载已簇生成的流动池，并开始测序。

序列分析查看软件将自动启动。约26小时后，通过高序列控制软件和序列分析查看软件监测测序数据质量，以评估数据质量并进行任何故障排除。然后，在测序完成后，更换流动池垫圈，并在开始下一次运行前执行维护性清洗。

对暴露于污染物的树突状细胞进行流式细胞成像后，打开 ImageJ Fiji 软件，将未暴露组和暴露于污染物的人树突状细胞样本组各自保存的 100 个细胞图像合并为单独的文件，按处理组别分类。为分析两组细胞中 CD1d 与 Lamp1 的共定位情况，打开污染物暴露组的 100 个细胞合并图像，选择 Image（图像）、Color（颜色）和 Split Channels（拆分通道），将图像拆分为两个独立图像，每个通道包含单一荧光标记。为生成共定位像素的散点图，选择 Analyze（分析）、Colocalization（共定位）和 Colocalization Threshold（共定位阈值），然后按 Print Screen 键保存散点图。

为了计算每张单细胞图像的曼德共定位系数，使用椭圆选择工具在具有分通道的图像文件上选择一张单细胞图像，然后再次选择“分析”、“共定位”和“共定位阈值”。接着在对话框中为感兴趣区域选择通道1，然后单击“确定”。当所有100张细胞图像的系数计算完成后，将结果导入适当的电子表格中，并对未暴露的对照细胞样本重复该分析。通过RNA测序和转录组数据分析，在污染物暴露的树突状细胞（DCs）中鉴定出多个显著改变的基因簇，包括脂质代谢和内吞功能相关基因簇。

在单细胞图像水平上，可根据CD1d和Lamp1的共表达情况对HLADR阳性CD11c阳性树突状细胞进行圈选。对照组未暴露于污染物的树突状细胞显示CD1d与Lamp1蛋白的共定位极少，表明在生理条件下CD1d的内吞转运处于基础水平，且表面表达水平较高。而在暴露于污染物的树突状细胞中，CD1d滞留在晚期内吞区室中，证实了该实验细胞群体的内吞相关基因表达谱发生改变。

将各个细胞图像合并为单个图像文件后，可根据其荧光基团的表达情况将图像拆分为不同通道，并通过散点图可视化两个通道间像素强度的共定位情况。随后可利用曼德系数（Mander's coefficients）对两个处理组中CD1d与Lamp1蛋白之间的共定位程度进行定量分析。若共定位区域与非共定位区域间的蛋白强度存在异质性，则共定位的强度分布将不平行于共定位区域，因此基于像素强度进一步评估两种蛋白的共定位情况也十分重要。

一旦掌握，图像分析可在两小时内完成，RNA测序建库可在三小时内完成，前提是每种技术均正确操作。在进行该实验流程时，务必确保所有试剂已正确加载至相应位置，并且测序仪无任何泄漏。完成本流程后，可进一步采用其他方法，如micro RNA测序、外显子测序或肥大细胞测序，以分别回答有关全局micro RNA表达、基因突变或DNA甲基化的额外科学问题。

因此，在该技术开发完成后，将有助于从事细胞成像分析和下一代测序的研究人员探索环境污染物对基因表达和蛋白质功能的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立下一代测序实验，以及如何进行蛋白质共定位的成像分析。请务必注意，操作对人体血液样本中的有毒污染物化学品可能具有极高危险性。

进行这些操作时，应始终采取使用化学通风橱和个人防护装备等预防措施。