在形态学组织背景下利用RNA可视化遗传变异、短靶标及点突变 原位 杂交实验

该方法可用于解决神经科学、肿瘤学及其他领域的关键研究问题，例如脑组织和肿瘤微环境中的细胞类型特异性表达以及剪接变异体的空间定位。该技术的主要优势在于，能够在组织环境中以极高的灵敏度和特异性检测单个细胞中的外显子连接处、短序列以及点突变。本次实验操作将由本实验室的副研究员 Hell Pimentel 进行演示。

为制备组织，应在解剖后立即于室温下用10%中性缓冲福尔马林固定16至32小时。随后，按照标准程序对样本进行处理并包埋于石蜡中。使用切片机将包埋的组织切成厚度为5±1微米的切片。

将切片贴附于静电粘附玻璃载玻片上，并在室温下过夜空气干燥。在进行RNA NC2杂交实验前一小时，将贴好组织的载玻片放入载玻片架中，并在60摄氏度的循环空气烘箱中烘烤。在开始RNA NC2杂交实验前，确保杂交炉已预热至40摄氏度。

充分润湿加湿纸，去除残留水分，然后将盖子放在湿度控制托盘上。取20毫升市售10X靶修复试剂加入180毫升水中，配制成200毫升的1X靶修复试剂。将两个载玻片架放入蒸锅中。

在一个载片架中加入200毫升1X靶修复试剂，另一个载片架中加入200毫升水。使用蒸锅将两种溶液加热至沸腾。将50X洗涤缓冲液在40摄氏度下预热10至20分钟。

然后，将60毫升预热的50倍浓缩洗涤缓冲液与2.94升水混合，配制三升1倍洗涤缓冲液。在通风橱中，将100毫升Gill苏木精染液与100毫升水混合，配制50%的Gill苏木精复染液。将1.43毫升20%至30%的氢氧化铵加入250毫升水中，配制蓝化试剂。

在探针杂交前，将目标探针于40摄氏度预热10分钟。将七种扩增试剂（Amp 0至Amp 6）恢复至室温。开始样本脱蜡：从烘箱中取出切片，将载有组织的玻片浸入二甲苯中，在振荡条件下处理5分钟。

用新鲜的二甲苯再次脱蜡5分钟。在100%乙醇中振荡脱水2分钟。再用新鲜的100%乙醇重复一次，持续2分钟。

将载玻片置于60摄氏度的循环空气烘箱中干燥五分钟，直至完全干燥。接着，在室温下用约四滴即用型过氧化氢溶液孵育切片10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。倾去载玻片上的溶液，并用清水冲洗两次。

将切片浸入预热的水中略为漂洗，然后将切片置于200毫升靶修复试剂中，在100摄氏度的蒸锅中加热15至30分钟。从靶修复步骤中取出载玻片，用清水冲洗两次。再浸入100%乙醇中3分钟。

然后将载玻片置于60摄氏度的鼓风烘箱中干燥，直至完全干燥。载玻片干燥后，使用疏水笔在组织周围绘制一个约0.75英寸×0.75英寸的疏水屏障。室温下静置一分钟后，待屏障完全干燥。

将载玻片放入载玻片架中，并将载玻片架置于预热的控湿托盘内。每张载玻片上加入约四滴蛋白酶3，于杂交炉中40摄氏度孵育15至30分钟。倾去载玻片上的溶液，并用清水冲洗两次。

开始探针杂交步骤时，加入约四滴适当的即用型探针溶液，以完全覆盖组织切片。将载玻片置于40摄氏度的杂交炉中，孵育两小时以完成探针杂交。倾去载玻片上的溶液，并在200毫升1X洗涤缓冲液中室温洗涤载玻片，期间偶尔振荡，持续两分钟。

重复洗涤步骤。下一步是通过将切片与一系列扩增试剂孵育来扩增信号。在每张载玻片的切片上加入约四滴 Amp 0，确保完全覆盖组织，然后在杂交炉中于 40 摄氏度孵育 30 分钟。

然后倾去溶液，并在室温下用200毫升1X洗涤缓冲液洗涤载片，期间偶尔轻轻振荡2分钟。重复洗涤步骤。以相同方式，根据本示意图所示的温度和时间，将切片依次在Amp 1至Amp 6中孵育。

在载玻片经过一系列扩增试剂处理后，配制 Fast Red 染液工作液。将适量的 Fast Red-B 染液和 Fast Red-A 染液加入离心管中，充分混匀。倾去载玻片上多余的液体，然后将 Fast Red 染液工作液加入载玻片上。

将切片置于带盖的染色盘中，在室温下孵育10分钟。10分钟后，倾去Fast Red溶液，并用自来水上下浸洗切片两次。为复染组织切片，将切片浸入50% Gill苏木精溶液中，室温下处理2分钟。

用自来水冲洗载玻片，重复数次，直至载玻片透明而组织切片仍保持紫色。将载玻片浸入0.2%氨水溶液中2至3次进行返蓝。用自来水替换氨水，再冲洗载玻片3至5次。

将载玻片置于循环空气烘箱中，在 60 摄氏度下干燥 15 分钟，直至完全干燥。在盖玻片上滴加一至两滴封片试剂，将载玻片覆盖在盖玻片上，注意避免产生气泡。室温下静置干燥至少 5 分钟。

最后，在标准的明场显微镜下观察切片。设计了针对Double-Z外显子连接区的探针，用于检测两个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）胶质母细胞瘤样本中的EGFRvIII状态。两种野生型探针在两个样本中均检测到信号，表明这两个样本均表达野生型EGFR。

然而，突变型探针仅在EGFRvIII阳性样本中检测到信号，而在EGFRvIII阴性样本中未检测到信号。实验中包含了阳性和阴性对照探针。当对制备成FFPE细胞团块的Jurkat细胞进行短靶标检测时，使用靶向红色序列的反义或正义探针，针对CDR3-alpha和CDR3-beta的反义探针均显示出强烈的染色信号，而正义探针则几乎未检测到信号。

dapB 被用作阴性对照。该检测方法还能够检测点突变。在此示例中，设计了两个探针，一个用于检测 EGFR L858R 突变序列，另一个用于检测 EGFR L858 野生型序列。

突变型探针在EGFR L858R突变杂合的H1975细胞系中检测到信号，但在仅表达EGFR L858野生型的H2229细胞系中未检测到信号。野生型探针在两种细胞系中均检测到信号。进行该实验时，需注意正确固定组织，同时运行阳性和阴性对照探针，并在杂交炉中使用切片处理系统。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如使用细胞标志物的免疫组化染色）来回答更多问题，例如鉴定剪接变体或短靶序列在特定细胞类型中的表达。该技术一经建立，便为神经科学、肿瘤学及其他领域的研究人员探索组织环境中的可变剪接事件、鉴定空间定位的点突变以及原位可视化高度同源且较短的序列铺平了道路。请注意，使用中性缓冲福尔马林和二甲苯具有极高危险性，在操作过程中必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并穿戴个人防护装备。