用于单分子力谱的蛋白质共价固定

该方法有助于回答生物物理学领域的一些关键问题，例如蛋白质相互作用中单个蛋白质的结合强度。该技术的主要优势在于能够固定多种不同的生物分子。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为原子力显微镜悬臂探针的操作以及原子力显微镜本身的使用具有一定挑战性。

首先，戴上耐酸手套、安全护目镜和实验服。在通风橱内，使用无尘精密擦拭布蘸取异丙醇，清除多张载玻片上的粗大灰尘和污染物。

将洁净的载玻片转移至一个装有经双蒸水稀释的盐酸的直立玻璃罐中。用合适的盖子密封该罐，并将其置于超声波清洗仪中，在室温下处理90分钟。随后，将氮化硅原子力显微镜（AFM）探针转移至一块洁净的玻璃载片上，使探针尖端朝上。

将载玻片转移至避光的紫外光不透射室中，从上方用紫外光照射至少90分钟。此后，将染色缸中的盐酸更换为双蒸水，注意勿使玻璃表面干燥。用盖子密封染色缸，并将其重新放入超声波水浴中处理10分钟。

同时，将乙氧基硅烷聚乙二醇酸溶解于乙醇和双蒸水的混合液中，最终浓度为0.1毫克/毫升。密封该溶液以防止乙醇挥发。准备就绪后，将硅烷溶液分别倒入两个独立的培养皿中。

将洁净的玻璃载玻片放入一个培养皿中，将悬臂放入另一个培养皿中。使用帕拉膜将两个培养皿完全密封，防止乙醇挥发。将培养皿在室温下静置孵育90分钟。

此后，使用三个盛有纯乙醇的烧杯连续清洗悬臂梁和玻璃片。将清洗后的悬臂梁放置在干净的玻璃片上。将功能化的玻璃片转移至染色缸中。

将样品在 110 摄氏度的烘箱中固化 30 分钟。然后，将硅烷化处理的玻璃样品和悬臂梁置于真空干燥器中，保存时间最长可达一周。当准备开始随机固定蛋白质时，按照文本方案中的说明，配制含有 EDC 和 NHS 的标准磷酸盐缓冲液溶液。

用该溶液覆盖硅烷化处理的玻片。将硅烷化修饰的悬臂探针放入ECD/NHS溶液液滴中。室温下孵育10分钟。

接下来，将悬臂和载玻片依次在三个烧杯中冲洗，以彻底洗去多余的 EDC/NHS。将活化的玻璃载玻片转移至配有湿润纸巾的培养皿中。在玻璃载玻片的 EDC/NHS 活化区域加入一滴所需蛋白溶液，用封口膜密封培养皿，并在室温下孵育探针。

将所需的蛋白质溶液滴加一滴至装有湿润组织的悬臂梁盒中。然后，用 PBS 充分清洗悬臂梁探针。将探针放入盒中的液滴内，并盖上盒盖。

将探针在室温下孵育。随后，在玻璃载玻片背面标记蛋白质液滴的区域。使用三个盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯，依次彻底清洗玻璃载玻片和悬臂探针。

将清洗后的探针放入含有Tris缓冲盐水的容器中，在室温下放置20分钟。然后，用PBS彻底清洗载玻片和悬臂探针。将其分别置于盛有PBS的培养皿中保存，待使用时取出。

将一块新清洁的玻璃载玻片固定在原子力显微镜（AFM）样品台上，并用 PBS 缓冲液覆盖。接着，将制备好的悬臂探针固定在悬臂夹持器上，并将其放入 AFM 探头中。小心地用一滴 PBS 缓冲液润湿悬臂。

缓慢移动悬臂，使其朝向校准表面靠近，直至悬臂完全浸入PBS缓冲液中，但仍远离校准表面。使用AFM的俯视光学显微镜或倒置显微镜，将激光对准悬臂背面。将激光光斑置于靠近悬臂末端（即探针所在位置）附近，并调节AFM四象限检测器光电二极管上的位置，使反射的激光束位于光电二极管的中心。

接下来，在原子力显微镜（AFM）软件中打开校准管理器。为开始校准悬臂梁的灵敏度和弹簧常数，需谨慎接近基底表面，并记录一条力-距离曲线。在针尖与基底表面接触的撤回力曲线最陡部分拟合一条直线，以确定光杠杆灵敏度。

将悬臂从样品表面缩回，并记录悬臂距离表面至少100微米时的多个热噪声谱，然后使用原子力显微镜（AFM）软件提供的谐振子模型对热噪声谱进行拟合，以确定悬臂的弹簧常数。随后，缓慢缩回悬臂并将其从溶液中取出。移除用于悬臂校准的玻璃表面，替换为含有固定化蛋白质的样品表面。

缓慢移动湿润的悬臂，使其接近样品表面，直至悬臂完全被 PBS 缓冲液覆盖，但仍远离基底表面。接近表面后，在样品表面的不同位置记录多条力-距离曲线，接触力为 250 皮牛，接触时间为 1 秒， retract 长度为 2 微米， retract 速度为 1 微米每秒。在数据处理软件中，选择“打开力扫描批次”图标，以打开已测量的力曲线文件。

选择“通过调整弹簧常数重新校准V偏转”图标，将悬臂偏转转换为与力成正比的信号。然后选择“基线扣除”图标，从远离表面的力曲线区域中扣除回撤通道的基线，同时设定零力水平。选择“接触点确定”图标，以定义针尖与样品接触的位置。

选择“针尖-样品分离”图标，将高度信号转换为针尖-样品分离距离。此操作除了减去接触点位置外，还会扣除悬臂梁弯曲量，以计算基底表面与原子力显微镜针尖之间的距离。选择“拟合聚合物链模型”图标，并选择“可延展蠕虫状链”模型，以筛选断裂长度超过70纳米的力-距离曲线中的力峰。

排除非特异性相互作用，并对选定的峰应用可扩展的蠕虫状链模型。本研究中，蛋白质通过其可及的伯胺基团以随机取向共价固定。硅烷化聚合物层的原子力显微镜图像仅显示高度在约2至5纳米之间的微小表面起伏。

然而，经纤连蛋白功能化的表面显示出纤连蛋白分子高度约为10纳米。进一步观察发现，可识别出这些分子的二聚体结构。这些分子呈现紧凑形态，高出PEG表面涂层4至5纳米，长度约为120纳米。

随后研究了RRGA与纤连蛋白之间的相互作用力。在探针移动速度为每秒一微米的条件下记录的典型探针-样品分离曲线显示出较低的背景相互作用以及形态良好的相互作用事件，这些事件随后采用可延伸的蠕虫状链模型进行拟合。对拟合结果作图显示，在克服PEG连接子拉伸过程中的非特异性表面相互作用后，最多有19%的力曲线出现断裂事件，RRGA与纤连蛋白相互作用的平均断裂力为52皮牛，探针与样品间距约为100纳米。

在进行该实验操作时，需要牢记的是，单分子力谱数据包含多种信息，其结果会受到接触时间或回撤速度等参数设置的影响，因此本方案仅是完整数据分析的第一步。尽管该方法可提供有关单分子相互作用的信息，也可用于研究单细胞水平上的相互作用。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如单细胞力谱技术，以回答更多问题，例如：完整细胞如何与蛋白包被的表面发生相互作用。

请务必注意，使用酸和紫外光可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，应始终采取相应的预防措施，例如佩戴耐酸手套，并使用防紫外光透过的防护罩。