原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

本方案详细介绍了如何利用单个T细胞和固体颗粒对原子力显微镜（AFM）悬臂梁进行最佳功能化修饰。这些探针尖端可用于分别研究单对树突状细胞与T细胞之间的相互作用，以及监测尺寸不稳定的细胞响应。该技术的主要优势在于采用了一种生物相容性胶水，用于实现悬臂梁的单个T细胞功能化修饰。

这种胶对真核细胞呈惰性，因此可使T细胞保持在基础激活状态。这些方法有助于深入了解免疫细胞的激活过程以及复杂的细胞间事件，例如免疫突触的形成。这些方法还可拓展应用于涉及细胞-细胞或细胞-表面相互作用的其他系统。

对于初次使用该技术的研究人员，重要的是确保T细胞在使用前处于良好状态，并用IL-2预处理过夜。此外，使用生物相容性胶水时应迅速操作，以避免不必要的氧化。开始本实验前，请按照文本方案中的步骤准备用于显微镜观察的单个T细胞。

然后，准备接种有 DC2.4 细胞的玻璃盖玻片，并将细胞在 37 摄氏度、5%CO2 的湿润培养箱中孵育过夜。使用食人鱼溶液处理、等离子清洗或紫外-臭氧清洗法清洁低弹性系数的柔软无针尖悬臂。随后，将清洁后的悬臂安装至原子力显微镜（AFM）扫描头。

接下来，准备一个洁净的样品室，并用纯水填充。首先在玻璃基底上采集一条力-距离曲线，以获得悬臂的灵敏度，从而在水溶液中对悬臂进行校准。然后，记录热噪声谱以提取弹簧常数。

当悬臂梁校准完成后，将原子力显微镜扫描头从溶液中取出。用几滴纯乙醇清洗固定好的悬臂梁，并保持悬臂梁在扫描头上的干燥状态。将活细胞培养环境腔室预热至37摄氏度，含5% CO2。

然后，将接种有 DC2.4 细胞的玻璃盖玻片安装到样品室组件中，并立即向腔室内加入 600 微升的 B 培养基。将组装好的样品置于原子力显微镜（AFM）样品台上。将经人 IL-2 孵育的 CD4 阳性 T 细胞加入样品室中。

等待靶向T细胞完全沉降到盖玻片底部后，将细胞移至显微镜视野中。接着，用移液器吸取2微升生物相容性胶水，滴加到固定好的悬臂末端。一旦将生物相容性胶水施加到悬臂上，后续步骤需尽快完成，以最大程度保证粘附效果。

迅速将扫描头放置在样品台上，使涂有胶水的悬臂浸入溶液中。移动样品台，直至一个健康的T细胞位于悬臂尖端下方。然后，通过微调扫描头的位置进行精细定位。

接下来，手动降低悬臂。首先以 50 微米的步长开始，然后根据悬臂图像的清晰度逐渐减小至 10、5、2，最后为 0.5 微米。现在保持步进电机的位置，并调节扫描头的位置，以更好地对准悬臂尖端与细胞。

持续操作直至激光位置出现微小位移，表明已形成牢固接触，对应的典型作用力为 0.5 至 1.5 纳牛。接触 30 秒后，收回悬臂。如果细胞随悬臂一起移动，则表明附着成功。

如果未成功，可在更换新的悬臂梁之前，重复粘附步骤最多三次。通过移动样品台和扫描头，将已附着的T细胞定位在DC2.4细胞上方。设置合适的参数后，在样品上进行力谱测量。

进行新一轮探测时，安装一个新的洁净悬臂梁。在纯水中对其进行校准，然后返回至T细胞-树突状细胞对并重复扫描。将一块已清洁的玻璃盖玻片安装到样品室组件上。

在盖玻片的左侧，加入一滴用乙醇稀释的六微米直径聚苯乙烯微球溶液。待溶剂挥发后，使用配备20倍物镜的明场显微镜检查微球的间距。确保各个微球之间充分分离。

然后，将微量移液器吸头或牙签浸入充分混合的环氧胶中，并通过连续轻触的方式，将少量胶水转移至盖玻片右侧靠近中心位置的三个不同点，如图所示。接着，将一个已清洁、无针尖的悬臂安装到原子力显微镜（AFM）扫描头，并在空气中使用洁净表面进行校准，以获得其弹簧常数。随后，将悬臂针尖定位至最后一个环氧胶点的左侧边界，并通过步进电机以较小的步长缓慢地将悬臂靠近胶滴。

一旦探针与胶接触，立即通过向后移动原子力显微镜扫描头，快速将悬臂在侧向上拉开。通过在玻璃上擦拭去除多余的胶，仅在针尖末端留下极少量的胶。现在，将悬臂针尖移动到一个孤立良好的微珠上方。

缓慢接近单个微珠，并以2至5纳牛顿的力与其稳定接触约10秒。接触过程中，使用微调装置将微珠精确定位于针尖末端。接触结束后，将针尖回撤。

如果微珠从原始焦平面上消失，则表明已发生成功的黏附事件。最后，小心拆下修饰有微珠的悬臂，并将其放入悬臂盒中过夜，使环氧树脂充分固化。以下是单个T细胞与单个树突状细胞在一次接近-回撤循环过程中结合相互作用的典型力-距离曲线。

浅红色曲线为延伸曲线，深红色曲线为回缩曲线。曲线中的最小值反映了T细胞与树突状细胞之间最大黏附力的大小，曲线下的面积则表示将两者分离所需做的功。曲线中出现的尖锐且呈阶梯状的断裂事件，可解释为由于细胞-细胞界面处存在强结合，在持续拉力作用下，细胞表面被拉伸出膜纳米管结构，随后该结构发生离散性断裂所致。

此处，传统T细胞与树突状细胞的结合以灰色表示，调节性T细胞与树突状细胞的结合以蓝色表示。传统T细胞与调节性T细胞之间的黏附力可识别抗原呈递细胞所呈递的肽类抗原，而调节性T细胞是一类抑制性T细胞，可在免疫反应末期关闭由传统T细胞介导的免疫应答。该图示为一个荧光标记的吞噬性RAW264.7细胞，显示一个直径为六微米的裸露聚苯乙烯微球正接近该细胞。

当微珠与细胞接触后，膜上的PIP2在接触位点附近b处发生分选，进而诱导膜招募moesin，最终引发吞噬事件。除了本文所述方法外，基于原子力显微镜的单细胞力谱技术还可与荧光成像结合，用于在单细胞水平上实时研究免疫细胞的活化过程。结合荧光技术，该方法能够实时解析更为复杂的细胞过程，例如树突状细胞与T细胞之间免疫突触的形成。