通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

以下实验的目的是通过微接触印刷技术生成排列有序的功能性心肌组织。首先在聚二甲基硅氧烷基底上进行纤维连接蛋白的微接触印刷，然后进行双转基因操作。

通过体外分化胚胎干细胞系，并利用荧光激活细胞分选技术进行分离，从而获得高度纯化的强心源性前体细胞。随后，将分离得到的心脏前体细胞接种到微图案化PDMS基底上，以促使其定向排列并呈现类似心肌细胞的杆状形态。根据实验事实及免疫荧光分析结果，证实了心脏前体细胞的成功分离及其各向同性生长。

生成各向同性心肌组织有助于推动干细胞生物学和组织生物工程领域的发展，为药物研发和发现提供疾病特异性的细胞检测方法，并为心脏再生医学奠定基础。首先，取10:1比例的IL guard 180 4聚二甲基硅氧烷弹性体及其固化剂，充分混合。

使用干燥器脱气以去除任何气泡。将PDMS倒入先前制备的模具中，该模具具有20微米宽、2微米高的凸脊，凸脊之间间隔20微米，然后在室温下的干燥器中固化两天，以获得具有微结构纹理的PDMS印章。使用等离子清洗仪使PDMS印章表面变为亲水性后。

用70%乙醇对印章进行消毒，持续一分钟。在生物安全柜中，用压缩空气快速吹干。在无菌印章表面覆盖纤连蛋白溶液，吸收至少10分钟后使用。

将纤连蛋白溶液从印章上甩掉，并用压缩空气快速吹干。按照文本方案所述，将印章与先前制备的PDMS包被的玻璃盖玻片紧密贴合接触两分钟，并用力按压。用蒸馏水冲洗微图案基底。

若非立即使用，将它们置于4°C的蒸馏水中保存，最多不超过两周。用无菌的0.1%明胶溶于蒸馏水包被6孔板，在37°C孵育15分钟使其充分吸收。在此期间，取一 aliquot 小鼠胚胎成纤维细胞，加入50毫升PBS至锥形管中进行制备。以1000 RPM离心5分钟，然后重悬于meth培养基中。

孵育时间结束后，吸除多余的明胶，并将 MES 加入孔中。让 MES 附着一天。取适量冻存的胚胎干细胞（ES 细胞），加入 50 毫升 PBS 至锥形管中，混匀后离心。

将ES细胞在1000 RPM下离心五分钟，然后用ESC培养基重悬。将ES细胞加入含有基质的孔中，并在ESC培养基中培养至细胞融合，以维持融合状态的ES细胞。首先吸除ESC培养基，并用无菌PBS洗涤细胞一次。

然后吸去PBS，向孔中加入500微升胰蛋白酶溶液。在37摄氏度下孵育3.5分钟。用移液器将胰蛋白酶溶液上下吹打数次。

首先将ES细胞集落打散。然后加入500微升ES细胞培养基至孔中，以中和胰蛋白酶溶液。根据所需比例传代ES细胞，此处ES细胞以1:30的比例进行传代，使其在三天内达到汇合状态。

当ES细胞达到汇合时，开始体外分化。首先用无菌的0.1%明胶（溶于蒸馏水）包被10厘米培养皿，在37摄氏度孵育15分钟使其充分吸收。在此期间，按前述方法收集ES细胞。

15 分钟后，吸除多余的明胶，并将约三分之一至一半的 E ES 细胞悬液加入含有适应培养基的培养皿中。在适应培养基中培养细胞两天后，用 1.5 毫升胰蛋白酶将已适应的 ES 细胞收集至含有 PBS 的 50 毫升锥形管中。以 1000 RPM 离心五分钟，然后重悬于分化培养基中。

在15厘米培养皿中，每10微升分化培养基液滴内制备约含1000个细胞的胚胎体（EBs）。使用多通道移液器将培养板倒置，使胚胎体以悬滴形式在37摄氏度下培养两天半。

经过两天半后，使用分化培养基将六至八个 15 厘米培养皿中的 EBS 收集到一个培养皿中，并继续培养三天半。再经过三天半后，将 EBS 收集至一个 50 毫升锥形管中，并用无菌 PBS 洗涤培养皿一次，以收集所有 EBS。然后静置约五分钟，使其沉降至管底。

然后去除上清液，用无菌 PBS 清洗 EBS。让 EBS 再次沉降至底部，静置约五分钟。加入 2.5 毫升胰蛋白酶消化液，于 37°C 水浴中轻轻振荡试管两分钟，以解离 EBS。

然后向胰蛋白酶溶液中加入 2.5 毫升无菌 PBS，用 10 毫升血清移液管上下吹打约 8 到 10 次，以分散细胞团块。用含有 7.5% ES 细胞或分化级 FBS 和 0.01% DPI 的 PBS 配制的 10 毫升 Fax 缓冲液中和胰蛋白酶，将解离的 EBS 细胞在 1000 RPM 条件下离心 5 分钟。随后弃去上清液，加入约 1 毫升 Fax 缓冲液，用 1 毫升移液器上下吹打约 8 到 10 次，以进一步分散细胞团块。

将细胞转移至含有35微米细胞筛网的无菌圆底管中，以获得单细胞悬液。使用Aria流式细胞仪对分化后的ES细胞进行分选，获得纯化的已定向心室前体细胞群体。详细的门控策略请参见实验方案的文本部分。

用1% Pluronic F127的蒸馏水溶液处理微图案基底10分钟，然后用无菌PBS洗涤三次。在图案区域周围贴附PDMS垫圈，并用力压紧。

然后将心脏前体细胞接种到纤连蛋白微图案基质上。以下图像来自体外分化第6天胚胎干细胞的代表性流式细胞术图谱。该图像显示了对前向散射幅度（FSCA）和侧向散射幅度（SSCA）的设门。

这可以实现完整细胞与细胞碎片的分离。此处显示了基于FSCA和前向散射宽度FSCW的设门。这能够将单个细胞从双联体及其他细胞聚集体中分离出来。

该图像显示了基于SSCA和SSCW散射的设门，这可提高单细胞的纯度。该图像还显示了基于FSCA和DPI染色的设门，从而能够从非活细胞中分离出活的DPI阴性细胞。

此处显示了在DI七号PE SI七中对菲可、丽茵、PE和PE氰的门控，从而能够获得真正的红色阳性细胞和真正的红色阴性细胞，并排除自发荧光的红色阴性细胞。这些图像显示了对异硫氰酸荧光素、振幅适配CA以及PEA的门控，可在红色阳性与红色阴性细胞群中进一步分选出真正的绿色阳性与真正的绿色阴性细胞。

通过体外分化ES细胞的FACS纯化，从该流式细胞术图中可见四种不同的前体细胞群体。这四种不同的前体细胞群体分别为红色阳性绿色阴性、红色阳性绿色阳性、红色阴性绿色阳性以及红色阴性绿色阴性。该代表性免疫荧光显微镜图像显示了微图形化纤连蛋白基底。

比例尺代表 80 微米。该图像显示了胚胎来源的类器官在纤连蛋白微图案上培养额外五天后的代表性免疫荧光显微照片，上层面板为分离的前体细胞，下层面板为 ESL 来源的类器官，分离的前体细胞经培养后细胞核染成蓝色。S-M-M-H-C-A 染成红色，肌节α-肌动蛋白呈绿色。

比例尺为 40 微米。观看本视频后，您应能够充分理解如何从可再生的心脏前体细胞来源生成各向异性的功能性心肌组织。