模拟囊胚发育与着床的人类胚状体实验方案

由于人类胚胎的可获得性较低且存在伦理问题，人类胚胎研究受到限制，因此获得能够真实模拟早期人类发育的个体模型将有助于科学和医学的进步。该技术预测人类发育的能力取决于其能否有效重现囊胚细胞决定和形态发生的序列，包括发育的顺序和节奏，此类模型将确保形成真正反映囊胚阶段的细胞。未来，人类囊胚样结构（blastoids）可能被用于识别治疗靶点并促进临床前建模，例如优化体外受精培养基，或开发非激素类避孕药。

演示该实验步骤的人员为 Harunobu Kagawa、Alok Javali、Heidar Heidari Khoei、Theresa Maria Sommer 和 Giovanni Sestini。首先，准备并预热 PXGL 培养基、N2B27 基础培养基、洗涤缓冲液、PBS 和聚集培养基。在形成胚状体时，需从 hPSC 悬液中去除 MEFs。

为排除MEF，通过向六孔板的孔中加入1毫升0.1%明胶制备明胶包被的培养板。将培养板在37摄氏度孵育30至90分钟。收集细胞时，移除培养基，并用1毫升PBS洗涤细胞。

向六孔板的每个孔中加入 500 µL 细胞解离溶液，在 37°C 下孵育 5 分钟。在显微镜下观察细胞，以监测集落解离为单个细胞的过程。用 1 mL 洗涤缓冲液稀释细胞解离溶液。

用移液器轻柔吹打5到10次，从培养板中收集细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在200 RCF下离心4分钟，沉淀细胞。

吸去上清液，然后将细胞重悬于每孔1.5毫升的PXGL培养基中。将细胞接种至明胶包被的培养板中用于MEF去除，并在37摄氏度孵育60至90分钟。一旦初始态细胞接种用于MEF去除后，即从MicroWells中移除PBS，并向每个MicroWell芯片中加入200微升基础N2B27培养基以平衡孔内环境，于37摄氏度孵育60分钟。

收集含有未贴壁的初始细胞的上清液，转移至15毫升离心管中，在200 RCF下离心4分钟以沉淀细胞。弃去培养基，将细胞重悬于1毫升N2B27基础培养基中。

使用细胞计数板对细胞进行计数。在200 RCF条件下离心4分钟。弃去上清液，加入适量含有10 µM Y27632的N2B27培养基，调整细胞密度至每50 µL含30,000个细胞。

从已平衡的微孔阵列中移除培养基，加入含10 µM Y27632的25 µL N2B27培养基。加入50 µL细胞悬液，于37°C孵育15分钟，使细胞沉降至微孔底部。随后加入125 µL N2B27培养基，补充10 µM Y27632。

24 小时内，将在 MicroWell 芯片上观察到 naive hPSCs 的聚集体。通过配制 PALY 培养基启动类囊胚的形成，并将其在 37 摄氏度预热 30 分钟。

移除聚集培养基，向微孔中加入 200 微升预热的 PALY 培养基。将细胞培养板放回 37 摄氏度的低氧培养箱中。在第 1 天重复更换培养基。

第2天，移除PALY培养基，加入200微升N2B27培养基，添加LPA和10 µM Y27632。第3天重复换液。第4天完成类囊胚的形成。

按照前述方法制备未分化的hPSC细胞悬液用于囊胚样结构形成。弃去培养基，加入适量含有10微摩尔Y27632的N2B27培养基，使细胞密度达到每100微升培养基含70个细胞。为使细胞在孔板底部聚集，将孔板在室温下以200 × g离心2分钟。

在37摄氏度的低氧培养条件下孵育培养板。24小时内，可在孔中观察到初始态hPSC的细胞聚集体。向孔中加入100微升新鲜配制并预热的两倍浓度PALY培养基。

将细胞培养板放回37摄氏度的低氧培养箱中。24小时后，弃去一半培养基，并加入100 µL预热的PALY培养基。重复此步骤至第4天。

按照前述方法制备初始态HPSC细胞悬液以形成滋养层球体。初始态HPSC聚集体在24小时形成后，将聚集体培养基更换为不含LIF的PALY培养基，并添加3 µM SC144，以形成代表早期滋养外胚层的滋养层球体。为形成代表成熟滋养外胚层的滋养层球体，将聚集体培养基更换为PALY培养基，并添加2 µM XMUMP1。

每天更换培养基。到第四天时，滋养层球体完全形成。为评估细胞状态，将类囊胚和滋养层球体的转录组数据与相应的对照组进行比较，包括类植入后的人滋养层干细胞。

在PXGL培养基中培养的 naive hPSCs 经 PALY 诱导后，于48至72小时之间形成聚集体并出现空腔结构，在96小时内直径达到150至250 µm。根据形态测量参数及三种谱系的存在情况，诱导效率达到70%至80%。Trophospheres 在诱导后96小时内以50%至60%的效率形成。在优化的诱导条件下，Blastoid 可在市售的超低吸附96孔板中成功形成。

采用单细胞RNA测序技术进一步表征囊胚样细胞状态。无论使用何种参数进行数据聚类与可视化，细胞均表现出高度可重复的显著不同聚类特征，从而能够可靠地区分出三种囊胚谱系。在24至60小时期间，PXGL多能干细胞形成了类似于上胚层和滋养外胚层的结构。

随后在60至96小时之间，形成极性滋养外胚层和原始内胚层的类似结构。这与囊胚内细胞谱系特化的顺序一致，因此类囊胚重现了谱系特化的发育序列。将类囊胚的数据集与来自不同发育阶段胚胎细胞的参考数据集进行整合分析显示，97%的类囊胚细胞与囊胚期细胞聚类在一起，而不与植入后胚胎的细胞聚类。

独立分析证实，随着时间推移，这些干细胞形成的细胞在转录水平上与人类胚胎第5天至第7.5天的细胞相匹配。这正是人类胚泡形成的发育阶段。研究还证实，类胚体中超过95%的细胞具有与胚泡三种细胞谱系相匹配的转录组，而约3%的细胞偏离目标，与着床后阶段的细胞相匹配。

值得注意的是，我们观察到最初的二维培养物中也包含约 5% 的非靶细胞。通过观察特定标志物的表达模式，例如囊胚滋养层细胞的 CDX2 和囊胚上胚层的 PRMD14，也可以可视化相应的发育阶段。初始 PXGL 培养的质量至关重要，初始聚集体中的细胞数量同样关键，可通过 MicroWells 进行控制。

24小时后，细胞聚集体的总体大小应约为50至70微米。具有完整阶段的类囊胚高效形成，为研究人类胚胎的着床过程及着床后发育开辟了道路。