用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

通过多重条形码成像分析获得的大量生物学信息，使科学家能够更深入地理解肿瘤微环境以及肿瘤细胞内的空间分布。该方法的主要优势在于，能够在相同的组织样本中提供更为详细的信息，从而实现对单个细胞进行更深层次的表型分析。该技术可定制化地构建检测面板，用于研究肿瘤微环境，有望在肿瘤组织中发现可用于新靶向治疗的预测性生物标志物。

开始寡核苷酸偶联抗体染色时，将盖玻片在室温下浸泡于0.1%多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）溶液中24小时，以准备组织的放置与贴附。倒掉多聚赖氨酸溶液后，用超纯水清洗盖玻片30秒。清洗后，将盖玻片从超纯水中取出，置于无绒布巾上过夜干燥。

将目标组织的5微米厚切片置于多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中央，室温下过夜干燥。将盖玻片架于60摄氏度烘箱中预热过夜。将含有组织切片的盖玻片放入预热的盖玻片架中。

在 60 摄氏度下烘烤 30 分钟后，检查确认石蜡已从组织上完全熔化脱离。迅速将含有样本的盖玻片架依次放入一系列溶液中。最后，将盖玻片架置于经 DEPC 处理的超纯水中，每次 5 分钟，共进行两轮。

通过将浸湿的纸巾置于空的移液枪吸头盒底部来准备一个湿度箱。在压力锅中加入水，水量需足以覆盖50毫升烧杯一半的高度。在4摄氏度下，每个样品向烧杯中加入5毫升甲醇。

用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水将所需体积的AR9缓冲液稀释至1X。接着，取一个50毫升的玻璃烧杯，加入约40毫升稀释后的AR9缓冲液。将带有样本的盖玻片架放入烧杯中，并用铝箔完全覆盖烧杯。

将覆盖铝箔的烧杯放入盛有水的压力锅中，在约15 PSI条件下加热20分钟。然后取出烧杯，小心地揭开铝箔，让烧杯在室温下冷却约10分钟。

从1X AR9缓冲液中取出盖玻片架，在经DEPC处理的超纯水中孵育两次，每次两分钟。同时，从多重成像染色试剂盒中取出水化缓冲液、抗体稀释液以及阻断溶液N、G、J和S。

将盖玻片样本先后置于5毫升水化缓冲液中各2分钟，共两次。随后将盖玻片样本放入5毫升多重成像抗体稀释液阻断液中，于室温孵育20至30分钟。在孵育期间，配制抗体混合液。

孵育后，将盖玻片放入先前准备好的湿盒中。用移液器将190微升抗体混合液加到盖玻片样本上，在室温下孵育三小时。接着，用5毫升多重成像抗体稀释液阻断剂洗涤样本两次，每次两分钟。

为了将结合的抗体固定在组织上，将盖玻片在储存液稀释至1.6%的16%甲醛中孵育10分钟，并用PBS洗涤三次。将盖玻片在甲醇中孵育5分钟后，预冷至4摄氏度。洗涤后，将盖玻片再次在5毫升用PBS稀释的固定剂中孵育20分钟，然后用PBS洗涤三次，再进行储存。

按照文中提到的成分配制报告基因主混合液。在96孔板中加入245微升含有报告基因主混合液及该实验周期特异性条形码荧光染料的溶液至一个孔中。该图显示了此处用于癌细胞系 panel 的报告基因板配置。

为保护条形码荧光染料，将铝箔板盖贴附于96孔报告板上，并将该板放入多重成像仪器中。使用DAPI通道进行成像聚焦校准：将样本盖玻片置于显微镜载物台上，手动移液700微升1:1500稀释的核染色溶液至组织上。为准备多重成像仪器，使用DEPC处理的超纯水将10X多重成像缓冲液稀释至1X，并向试剂瓶中加入相应的溶液或溶剂。

设置显微镜的所有参数，并在样品盖玻片上选择需要成像的感兴趣区域。将实验设计输入仪器管理软件中。在控制软件中点击“实验”按钮，然后在“实验设置与管理”窗口中点击“新建模板”按钮。

在“项目”按钮旁边的空白处输入项目名称，并输入总循环次数。单击“通道分配”按钮，将每个循环的信息填入对应列中，例如正确的循环编号、孔板编号、Z轴层位置、标记物名称、类别以及每个循环的曝光时间。然后单击“开始实验”以启动实验，并保存实验设置。

单击计算机上的 QuPath 图标，打开该软件。将 qptiff 文件拖动到查看器窗口中。单击亮度和对比度按钮，以打开亮度对比度窗口。

通过勾选或取消勾选所选列中的标记，来显示或隐藏该标记信号。点击“缩放以适配”按钮，可放大或缩小目标区域。使用图像分析软件查看时，复合图像将按需显示所有标记或选定的标记。

所有标记物的信号强度、动态范围和空间分布均得以揭示。该技术能够在单个组织切片中实现26种标记物在亚细胞水平的同时分析。在完成多重图像分析后，可通过生物信息学方法对高维度的单细胞数据进行处理和分析，从而推断出生物学和临床意义。

多重条形码图像分析是一种强大的方法，可使科研人员对肿瘤组织进行分析，并根据检测面板中的标志物回答其研究问题。