利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

该方案利用了原子力显微镜（AFM）的全部主要特性，而这些特性是其他单分子技术所不具备的。因此，我们能够在纳米尺度上解析核小体的结构。尤为重要的是，核小体的直接可视化是在生理条件下完成的。

利用我们的原子力显微镜技术，我们近期揭示了着丝粒核小体的独特性质，这些性质可能在整条着丝粒的功能中发挥重要作用。本文所展示的方法目前在我们实验室中被用于研究与淀粉样蛋白聚集体形成相关的蛋白质自组装过程。这类蛋白质聚集体可引发多种严重疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病等。

这些简单的制备方法也适用于其他蛋白质-DNA复合物，包括诸如DNA复制机器之类的大体系，尽管需要进行一些修改。为了利用静态和时间序列原子力显微镜在单分子水平上表征核小体颗粒，首先需按照随附的文字实验方案对核小体进行纯化、组装和验证。

接下来，准备静态原子力显微镜成像所需的云母表面。首先，用去离子水配制50 mM的APS储备液。将该溶液分装成每份1 mL，于4°C保存，直至使用时取出。

从储备液中，通过将50微升的50微摩尔APS储备液溶解于15毫升去离子蒸馏水中，制备用于云母修饰的工作浓度APS溶液。混匀溶液后，取部分溶液注入比色皿中。接着，从高质量云母片上切割出1厘米×3厘米的云母条。

将云母片对角线方向放入比色皿中，检查其是否合适。然后将云母层层剥离，直至两侧均呈新鲜剥离状态，且云母片厚度约为0.1毫米。立即将云母片放入盛有APS的比色皿中，孵育30分钟。

将云母片转移至盛有去离子蒸馏水的比色皿中，浸泡30秒。随后，使用氩气彻底干燥APS云母条的两面。将双面胶带贴在多个磁性样品托上，并将其放置在旁边备用。

然后，将 APS 云母基底切割成 1 厘米 × 1 厘米的正方形，并将其置于洁净的培养皿中覆盖保存。接着，使用孔径为 0.22 微米的滤膜过滤缓冲液（含 10 毫摩尔 HEPES 和 4 毫摩尔氯化镁，pH 7.5）配制组装好的核小体的三种不同稀释浓度。为减少核小体的损失，在较低终浓度条件下，应在沉积到 APS 云母基底前逐次进行稀释，并立即使用。

取每种核小体样品五到十微升，滴加在APS云母片的中心位置，静置孵育两分钟。随后，用两到三毫升去离子蒸馏水轻轻冲洗样品，以去除缓冲液成分。最后，在氩气轻柔气流下将样品干燥。

首先，在原子力显微镜（AFM）装置的探针支架上安装一个探针。然后，将第一个样品小心地放置在AFM载物台上，注意避免接触样品表面。调整激光位置使其对准悬臂，直到信号总和达到最大值，并调节垂直和横向偏转值至接近零。

然后，调节原子力显微镜（AFM）探针以找到其共振频率，调整驱动振幅，并将图像尺寸设置为100乘以100纳米。设置完成后，单击“engage”按钮开始接近样品。当接近过程完成后，逐步优化振幅设定值，直至清晰观察到样品表面。

然后，将扫描尺寸增大至1微米×1微米，分辨率提高至512×512像素。最后，点击采集按钮以开始图像获取。使用玻璃棒扫描仪胶水将玻璃棒固定到原子力显微镜（AFM）扫描仪载台上。

静置干燥至少10分钟。在此期间，从较大的云母片上打孔制备直径为1.5毫米、厚度为0.1毫米的圆形云母片。使用高速原子力显微镜（AFM）云母玻璃棒专用胶将该云母片粘附至高速AFM的玻璃棒上，并静置至少10分钟使其完全干燥，期间避免触碰。

然后，使用对压力敏感的胶带从云母上剥离层片，直至在胶带上观察到一个剥离良好的层。接下来，将1微升50毫摩尔的APS储备液溶于99微升去离子蒸馏水中，配制成500微摩尔的APS溶液。取2.5微升该溶液滴加到新近剥离的云母表面，静置30分钟使表面完成功能化。

孵育结束后，用三微升去离子蒸馏水多次冲洗云母片表面。每次冲洗后，将无纺布擦拭纸置于云母片边缘，彻底去除残留水分。最后一次冲洗后，在表面加入三微升去离子蒸馏水，静置至少五分钟，以去除任何非特异性结合的APS。

接下来，将探针放入高速原子力显微镜（AFM）样品 holder 中，并将 holder 放置在 AFM 样品台上，使针尖朝上。先用 100 µL 去离子蒸馏水冲洗 holder，随后用 0.22 µm 滤膜过滤的核小体成像缓冲液冲洗两次，每次 100 µL。完成冲洗后，向腔室中加入 100 µL 核小体成像缓冲液，浸没针尖。

调节悬臂位置，直至其被激光照射到。随后，用过滤的核小体成像缓冲液对APS云母片进行五次冲洗，每次使用四微升。取一微升核小体组装原液，加入250微升过滤的核小体成像缓冲液中稀释，得到终浓度为一纳摩尔的核小体溶液。

取2.5 µL该稀释液滴加于表面，静置2分钟。用4 µL核小体成像缓冲液冲洗表面两次，以避免过度密集。最后一次冲洗后，使表面保留成像缓冲液覆盖。

将扫描仪和样品放置在探针架顶部，使样品朝下。开始接近时，使用自动接近功能，设定点振幅接近自由振荡振幅。调节设定点，直到表面被良好追踪。

然后，将成像区域设置为约 150 × 150 纳米至 200 × 200 纳米，数据采集速率约为每成像帧 300 毫秒。作为组装与沉积的对照，制备 H3 单核小体并使用静态原子力显微镜（AFM）进行成像。该图像展示了核小体群体在沉积前瞬间的状态，证实核小体已成功组装。

在H3对照组装成功的基础上，接下来将所述方法应用于CENP-A核小体的研究。该样品的静态原子力显微镜成像结果显示其组装成功。通过静态原子力显微镜图像，可对单核小体的高度和螺旋圈数进行表征。

通过游离DNA臂之间的夹角以及游离DNA臂的长度来确定单个核小体中DNA的缠绕圈数。相比之下，核小体的时间序列原子力显微镜成像可用于直观展示核小体整体的自发解缠绕行为。随着核小体DNA缠绕圈数的减少，也可观察到核小体核心体积相应减小。

除了常规的时间序列成像外，高速时间序列原子力显微镜（AFM）还可用于研究标准时间序列成像难以捕捉的更复杂的核小体动态过程。该技术能够在长时间内记录动态变化，这对于可视化持续1200帧的CENP-A核小体核心的长距离易位过程至关重要。该技术在捕获CENP-A核小体核心从一个DNA底物罕见转移至另一个DNA底物的过程中也发挥了关键作用。

快速的图像捕获速率使得这一动态事件的可视化成为可能，因其仅需数帧即可完成。在广泛的染色质领域中，存在一系列重要问题，涉及组蛋白变体liger组蛋白以及组蛋白扩增在染色质动力学中的作用。所有这些问题均可通过我们的技术得到解答。