原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

单分子技术是研究染色质系统力学特性、协调机制和组成成分的有力工具，因此研究人员一直在寻求更优的方法来制备核小体底物。本文介绍了一种在单分子关联力与荧光显微镜中，直接在DNA上原位形成核小体的实验方案。通常，核小体底物是通过盐透析法，将核小体组装在含有强定位序列的DNA上而制备的。

尽管这种方法具有一些优势，但会产生人为稳定的核小体，并且试剂用量较大。我们的方案可在几分钟内无需特定DNA序列且使用更少试剂的条件下，制备用于单分子相关力与荧光显微镜研究的核小体底物。该方案能够实现天然DNA序列上的核小体组装，易于调节核小体密度，同时缩短制备时间并减少试剂使用量。

此外，原位形成的核小体DNA系连结构能够简化实验流程，并提供内置的单分子可视化与操控便利性。当实验无需严格要求核小体精确定位时，我们的研究结果可帮助科研人员更高效地在单分子水平上研究染色质及其结合蛋白。通过节省下来的时间和资源，可以开展更多实验，以进一步探究其他变量和条件。

我们目前考虑的相关研究领域包括由组蛋白变体及其他翻译后修饰所调控的染色质力学特性。我们也在关注其他染色质结合蛋白的生物物理相互作用及其动力学。最后，我们还研究核小体驱动的高级组装过程，例如生物分子凝聚作用。

首先，在流动池的第三通道中加入 500 微升无蛋白质的成像缓冲液。将 2 纳摩尔的酿酒酵母 Nap1 与 2 至 5 纳摩尔的 LD655 标记 H4 组蛋白八聚体混合于 500 微升 1XHR 缓冲液中。将此混合物加入流动池的第四通道。

以 1.0 bar 的压力使所有通道流动 30 秒，用样品冲洗通道。将流速设为 0.2 bar，然后将光镊移动至通道 1，捕获一对合适的链霉亲和素包被的微珠。接着，将光镊移至通道 3。

关闭流体，对磁珠对进行力校准。打开红色共聚焦激光，校准成像区域。将流速设为 0.2 bar 后，移动光镊至通道 2 以捕获生物素化 DNA。

然后将光镊移动至通道3，并停止流动。增大光镊之间的距离以拉伸DNA，同时监测相应的力-距离曲线，以确认存在单根DNA连接。调节光镊之间的距离，使DNA张力读数约为一皮牛顿。

打开线扫描，开始使用红色激光采集显微图像。然后在关闭流动的条件下将光镊移动至第4通道，以在DNA连接处形成核小体。如需解旋核小体，则将光镊移至第3通道。

将力读数设为零，速度设为 0.1 微米每秒，移动光镊 1 远离光镊 2。将 10 纳摩尔的 Cy3 标记连接组蛋白 H1.4 加入 500 微升成像缓冲液中，混匀后加入通道 5。在形成包含核小体的 DNA 拴系结构后，除红光激光外，开启绿光激光，并将光镊移至通道 5，以实时成像 H1 与染色质的结合过程。

通过二维扫描和明场图像，可在DNA系链上观察到静止的红色荧光焦点，表明核小体的形成。光漂白分析显示为一步或两步光漂白事件，提示存在单核小体。在缺乏Nap1的情况下，组蛋白八聚体仍可结合DNA，但大部分保持未缠绕状态，表现为持续的张力。

使用Cy3标记的H2a，获得的核小体组装结果与使用LD655标记的H4所得结果相似。核小体解旋随时间推移导致系留距离增加，在kymograph上可见，并产生具有特征性“撕裂”峰的受力距离曲线，这些峰代表单个核小体的解旋事件。染色质上连接组蛋白H1的结合表现为绿色荧光焦点，双色固定轨迹代表H1与核小体的结合，而绿色锯齿状轨迹则代表扩散状态的H1运动轨迹。