利用原子力显微镜观察重组DNA与蛋白质复合物

本实验的总体目标是利用原子力显微镜在水相缓冲液中实时成像生物分子（如 DNA 和蛋白质）。首先需制备待成像的生物分子，随后设置原子力显微镜并定位 FM 悬臂探针。

随后对样品表面及感兴趣的生物分子进行成像和分析。最终可通过原子力显微镜在缓冲条件下获得DNA和蛋白质以及异质性生物分子复合物的总体尺寸、数量和组织结构信息。该方法有助于解答分子伴侣领域中的关键科学问题，例如分子伴侣与共伴侣复合物结合客户蛋白时的空间构象（STO几何结构）是什么。

蛋白质 该方法的可视化演示非常有益，因为原子力显微镜（AFM）和Kent杠杆探针的制备步骤较为复杂，主要由于其物理操作的精细性，仅通过印刷说明难以掌握。本实验操作将由本实验室的两名学生摩根·香农（Morgan Shannon）和约翰·格茨（John Gertz）进行演示。首先，分离待成像的蛋白质或DNA分子，并将其悬浮于水相缓冲液中。在确认样品纯度后，将其置于冰上孵育于AFM吸附缓冲液中，以促进样品在云母表面的吸附。

对于蛋白质样品，使用 10 毫摩尔的 HEPES 缓冲液。对于 DNA 样品，含有镁离子的缓冲液由 10 毫摩尔 Tris（pH 7.5）、10 毫摩尔氯化钠和 2 毫摩尔氯化镁组成，适用于安装原子力显微镜探针。将液体池探针支架放置到相应的悬臂安装对接站上。

找到用于成像的尖锐氮化硅探针上的长而厚的悬臂。小心地将其转移至液体池探针 holder 中，确保探针尖端保持朝上。接着，在光学显微镜下检查悬臂，以确认其完整且正确安装在液体池探针 holder 中。

然后，通过拧紧神经头夹紧螺钉，小心地从仪器燕尾组件上取下原子力显微镜（AFM）探头。将原子力显微镜（AFM）探头倒置，并用力将液体池探头支架推入原子力显微镜（AFM）探头底部的四个插针上。最后，小心地将原子力显微镜（AFM）探头重新安装回仪器的燕尾组件中。

为了在成像样品前进一步准备原子力显微镜（FM），移动内置光学显微镜的旋钮以定位悬臂尖端，然后使用软件中光学控制器的上下箭头调节，使悬臂尖端处于焦点位置。使用激光调节旋钮将激光对准悬臂尖端。这是本实验方案中技术难度最高的步骤之一，定位过程需手动完成，要求精确调节旋钮。

仔细监测反射光斑和照明光斑中的激光，可提高成功准直的可能性。接下来，调节原子力显微镜（AFM）探头上的光电探测器旋钮，使光电探测器居中。将一片新解理并粘附在金属AFM样品圆盘上的云母片放置在位于AFM支架板顶部的磁化样品 holder 上。

旋转 FM 持有板，使样品圆盘处于初始成像位置。使用仪器软件的聚焦面控制功能，将 FM 探头向下移动至 MICA 样品圆盘表面。当 MICA 表面的明显特征或探针反射清晰对焦时，从仪器软件中选择调谐图标，并对悬臂进行调谐。

推荐的 MSNL 或 SNL 探针的共振频率为 20 至 60 千赫兹。选择 5% 的峰值偏移以对云母样品进行成像。首先，将探针与云母表面接触，设定初始扫描尺寸为 10 微米，扫描速率为 1 赫兹。

捕获10微米区域的完整扫描图像。然后将扫描尺寸减小至5微米、1微米和0.5微米，并分别捕获每个区域的完整图像。通过在仪器软件上单击脱离图标一次，使探针脱离。

为了成像目标生物分子，将5微升制备好的样品与45微升新鲜吸附缓冲液混合。小心地将50微升含有0.5微克/毫升生物分子的溶液直接加到MICUs表面。静置5分钟，使样品中的生物分子吸附到Micah表面。

然后用移液器向液体池探头支架中再加入 50 至 100 微升吸收缓冲液。注意不要触碰探头、FM 头或云母片，使用移液器尖端必要时重新调整光电探测器，并重新对准激光至悬臂。然后使用仪器软件重新使探头接触样品。

增大扫描范围以确定感兴趣区域。成像完成后，在仪器软件中多次点击退出图标，使探针脱离。最后，使用蒸馏水彻底冲洗液体池探针座和样品圆盘。

然后用压缩空气尝试。此处展示了一幅原子力显微镜（AFM）图像的示例。云母基底可提供分子级平整的表面，便于DNA和蛋白质吸附。

在生物分子样品成像之前对MICA进行成像，可提供阴性对照并评估成像噪声水平，同时也能确保探针已正确调谐，从而保证后续样品成像的成功。双链质粒DNA（推测为超螺旋构型）因其不对称的形态以及在原本无显著特征的MICA基底上均匀沉积的特性，可被清晰识别。

具有不同粒径的蛋白质复合物也可从Micah底物中明确区分。颗粒大小的差异表明样品的异质性，可用于估算蛋白质、复合物的化学计量比、几何构型或生物化学活性。所观察到的蛋白质颗粒呈现普遍的对角线形状和一致的取向。

此处为一种成像伪影，因为蛋白质在Micah基底上的取向通常是随机的。观察到的伪影可能由以下原因引起：探针物理性异常，或在过快的扫描速率下进行调频（FM）成像，同时由于探针卷积效应，导致无法在x和y轴方向进行绝对长度测量，也无法在z轴方向进行高度测量；但相对的x和y方向测量值仍可用于估算所成像生物分子的生物物理特性。在执行该操作时，必须牢记在遵循基本的调频（FM）成像流程后，准确调节悬臂梁并校准光电探测器。

还可以增加其他步骤，例如使用缓冲液交换流体池，以回答更多问题，如分子伴侣是否能够影响类固醇受体从其DNA反应元件上的释放。观看本视频后，您应能更好地理解如何在缓冲条件下利用原子力显微镜对DNA蛋白及生物大分子复合物进行成像。