一种快速定量的荧光法用于靶向蛋白质的小分子药物筛选

这种新型荧光检测药物筛选方法的总体目标是通过在载药蛋白质模板内形成荧光金纳米簇，测定小分子药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。该方法有助于回答蛋白质靶向药物发现领域中的关键问题，例如药物分子的结合强度如何影响蛋白质抵抗去折叠的稳定性，从而导致形成不同荧光强度的金纳米簇。该技术的主要优势在于，可将靶标蛋白转变为荧光生物传感器，从而实现对小分子药物的快速筛选，且无需复杂的仪器和繁琐的标记步骤。

结合我本人的知识以及合著者在发现加载蛋白质方面的工作，该蛋白质对等离子体纳米粒子具有显著的稳定作用，这启发了本方法的设计思路。开始实验前，首先按照文本方案中的说明准备药物筛选所需的化学试剂，以制备人血清白蛋白（HSA）模板化的金纳米簇。取两个玻璃小瓶，每个小瓶中放入一个微型磁力搅拌子，并将它们分别置于两个可控温的磁力搅拌器上。

将一个磁力搅拌器的温度设定为60摄氏度。随后，在持续搅拌条件下，向每个小瓶中加入200微升人血清白蛋白溶液、200微升超纯水和200微升氯金酸溶液，以使金离子在蛋白质模板内完成包封；两分钟后，向每个小瓶中加入20微升氢氧化钠溶液，以激活人血清白蛋白的还原能力，形成金纳米簇。从零分钟开始，每隔20分钟记录一次反应时间。

吸取每种样品 50 µL，转移至 384 孔黑色板中。使用微孔板读板仪测定发射光谱。在 100 分钟后停止磁力搅拌。

将玻璃小瓶置于水槽中流动的水下冷却。对每个样品在各个时间点绘制光发射光谱，以获得不同温度条件下金纳米簇的形成动力学。制备牛血清白蛋白（BSA）模板金纳米簇时，将含有微型磁力搅拌子的玻璃小瓶放置在磁力搅拌器上方。

保持温度为室温。在玻璃小瓶中，将200 µL BSA溶液、200 µL尿素和200 µL氯金酸溶液在持续搅拌下混合。两分钟后，加入20 µL氢氧化钠溶液。

为了激活BSA的还原能力以形成金纳米簇，并开始记录反应时间为零分钟。每小时测量一次反应混合物的光发射光谱。将五个玻璃小瓶分别放入一个磁力搅拌子，并在瓶顶预先标记药物或纯HSA，然后置于可调温的多点磁力搅拌器上。

向每支小瓶中加入 200 微升 HSA。然后向四个相应小瓶中分别加入 1 微升先前配制的药物溶液。同时，向搅拌器上的对照组中加入 1 微升 DMSO。

将转速设为 360 RPM，孵育 1 小时，使药物与 HSA 结合。1 小时后，在每支小瓶中加入 200 微升 Milli-Q 水和 200 微升氯金酸溶液，并持续搅拌。在持续搅拌条件下，将温度设为 60 摄氏度，反应 10 分钟。10 分钟后，向每支小瓶中加入 20 微升 1.5 摩尔的氢氧化钠溶液，并从零分钟开始记录反应时间。

用于测量的反应体系加样顺序应保持一致，并应尽快操作，以尽量减少时间延迟效应。迅速从每个小瓶中吸取50 µL溶液，转移至384孔黑色板中，并测定其发射光谱。每10分钟记录一次各样品的发射光谱，至少在四个不同时间点收集四次光谱数据。

重复这些步骤多次，以获得具有一致趋势的结果。绘制每个样品的时间分辨光发射光谱。确定所有样品的峰值强度，并将其对时间作图，以比较不同载药蛋白模板中金纳米簇的形成动力学，进而测量每种药物与人血清白蛋白（HSA）之间的结合常数。

将药物溶液替换为四种不同浓度的布洛芬溶液。10分钟后，将玻璃小瓶置于水槽中流动水下冷却。从每个小瓶中吸取50微升上述溶液至384孔黑色板中，并测定其发射光谱。

在停止磁力搅拌之前，重复上述步骤两次，以获得另外两组不同药物浓度下的实验结果。然后绘制各批次原始数据的光发射光谱，并对结果进行分析。使用 Origin Pro 等软件绘制每个样品的光发射光谱，并确定其峰值强度。

根据药物浓度计算并绘制相对荧光强度曲线，然后通过将数据拟合到单一位点结合模型来计算结合常数。可使用 Origin Pro 等软件中的 Mics cementin 方程完成该拟合。

选择菜单中的“分析”→“拟合”→“非线性曲线拟合”，然后在设置函数选择页面的“生长型S型曲线”类别中选择Hail函数。点击“拟合”以显示结果。此处显示的拟合结果代表了在不同蛋白质变性条件下制备的金纳米簇的时间分辨光发射光谱的典型结果。

可以观察到，在较高温度下，金纳米簇的形成速度更快。尿素变性条件也有助于以 BSA 蛋白为模板直接合成金纳米簇。此处展示了基于载药 HSA 为模板制备的金纳米簇的荧光强度进行快速荧光药物筛选的典型结果。

荧光强度越高，药物分子与人血清白蛋白（HSA）的结合强度越弱。这些光谱显示了药物负载浓度对载布洛芬HSA中荧光金纳米簇形成速率的影响。药物浓度越高，所生成的金纳米簇的荧光信号越低。此处所示为蛋白质-药物结合常数测定的一个代表性结果。

通过使用MICUs cementin方程拟合在预载不同浓度布洛芬药物的HSA模板中合成的金纳米簇的相对荧光强度来计算。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成，适用于平行进行多种药物的筛选。观看本视频后，您现在应已充分了解如何在载药蛋白中合成金纳米簇，以及如何通过所生成金纳米簇发出的荧光信号来测定药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。