在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

美国食品药品监督管理局（FDA）的科学与工程实验室办公室正在开发监管科学工具，以协助医疗器械开发者和FDA审评人员。我们的最终目标是通过当前最先进的科学手段，加快患者获得创新、安全且有效的医疗器械的进程。在本方案中，我们应用前沿的诱导性多能干细胞技术，对用于治疗危及生命的心脏疾病的医疗器械进行评估。

这种简单的工具可利用标准实验室设备在培养皿中对心脏电生理学设备进行可重复的评估。它还可与来自患有各种心脏病捐赠者的患者特异性细胞联合使用。首先，在将心肌细胞接种到柔性水凝胶基质上之前至少两天，将解冻的人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞接种于经0.1%明胶包被的无菌六孔板中。

将人iPSC来源的心肌细胞在标准心肌细胞培养基中培养2至4天，培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳，以使其从冻存状态中恢复。每48小时用100%心肌细胞培养基更换耗尽的培养基。在消化前通过评估细胞健康状况、确保细胞活力及稳定搏动，检查人iPSC来源心肌细胞的状态。

用不含氯化钙和氯化镁的 DPBS 洗涤心肌细胞，每孔加入 4 毫升。每孔加入 1 毫升室温解离试剂，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。接着，向无菌的 15 毫升锥形管中加入 10 毫升心肌细胞培养基。

使用1,000微升移液器将心肌细胞从六孔板中解离，并将细胞悬液加入锥形管中。用1毫升新鲜心肌细胞培养基冲洗各孔，以收集残留的心肌细胞，并将其加入锥形管中。然后用培养基将锥形管中的终体积调至15毫升。

将离心管在200 G条件下离心五分钟，弃去上清液至一毫升刻度线处。用心肌细胞培养基重悬细胞，终体积为五毫升，使用手动或自动细胞计数器对心肌细胞进行计数。接下来，在室温下孵育心肌细胞悬液约30分钟，同时准备柔性水凝胶基底。

在组织培养超净台中准备好一支设定为1微升的20微升移液器、移液器吸头、一个无菌的48孔玻璃底培养板以及一个秒表计时器。通过轻轻敲击管壁混匀细胞外基质（ECM）或基于ECM的水凝胶基质，随后立即放回冰上。在接种第一份水凝胶基质前立即启动秒表计时器，并将此时刻标记为时间零点。

将移液器吸头上下吸取约一微升水凝胶基质溶液三次，以冷却移液器吸头。然后，将约一微升未稀释的水凝胶基质溶液水平加至48孔板每个孔的底部，移液时保持移液器呈45度角。每个孔中的水凝胶基质应以相同方向接种，以便在40倍放大条件下进行实验时易于识别基质位置。

将盖子盖在48孔板上，置于组织培养罩内，室温孵育8至10分钟，然后再加入细胞。孵育结束后，立即在低培养基体积（约200微升心肌细胞培养基）条件下，将约30,000个活心肌细胞以滴加方式直接接种到水凝胶基质上，每孔接种约30,000个活细胞。盖上盖子后，将心肌细胞在罩内室温下静置孵育10至15分钟，避免扰动，以使细胞能够黏附于水凝胶基质上。

向每个孔中轻柔加入 100 µL 新鲜心肌细胞培养基。将盖好盖子的培养板放入 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 2 至 4 天。打开显微镜和环境控制腔室，使其平衡至 37°C 和 5% CO₂。

从48孔板中移除心肌细胞培养基，然后用600微升心脏收缩力调节（CCM）检测培养基轻轻冲洗每个孔两次。随后每孔加入300微升CCM检测培养基，将48孔板置于显微镜的环境控制腔室内。插入电极，使细胞平衡5分钟。

使用基于视频的显微技术记录收缩视频时，打开视频录制软件并将帧率设置为每秒100帧。然后在hiPSC-CM单层细胞的中央附近选择一个感兴趣区域（ROI）。随后使用商用脉冲发生器对细胞进行场刺激，以电刺激方式起搏二维心肌细胞单层。

将心肌细胞置于1.5倍阈值、1赫兹的基线脉冲参数下进行刺激。例如，采用单相方波起搏脉冲，刺激脉冲持续时间为2毫秒，电压为5伏。在CCM之前仅记录基线起搏收缩视频，至少持续5个搏动。

随后，使用实验性电刺激信号刺激心肌细胞单层，该信号具有30毫秒延迟、两个对称的双相脉冲，每相持续时间为5.14毫秒，总持续时间为20.56毫秒，每相振幅为10伏，相间间隔为零。记录至少五个心动周期的CCM诱导收缩视频。关闭CCM信号，改用基础起搏脉冲进行刺激，并记录CCM结束后恢复期的收缩视频，至少持续五个心动周期。

使用标准的收缩分析软件自动分析收缩视频，并量化关键的收缩特性，如收缩幅度、收缩斜率、舒张斜率、达峰时间、恢复至基线90%的时间以及50%收缩持续时间。对二维人源iPSC来源的心肌细胞单层的收缩特性进行了表征，并量化了心肌细胞收缩功能的关键参数。应用标准的CCM刺激参数后，体外心肌细胞的收缩功能得到增强。评估了在有或无CCM刺激条件下，细胞外钙离子浓度调节对人心肌细胞收缩特性的影响。

观察到收缩具有预期的基础钙依赖性，同时还观察到CCM可提高心肌细胞单层的钙敏感性。此外，通过药理学手段对β-肾上腺素能信号通路进行探究，揭示了CCM诱导的正性肌力效应部分由β-肾上腺素能信号通路介导。此外，该工具可进一步扩展至患者特异性的疾病心肌细胞，包括扩张型心肌病的心肌细胞，以理解CCM在疾病状态下的作用。

本文主要关注评估人类心肌的收缩特性。然而，利用该工具，还可以评估其他心脏兴奋-收缩耦联的检测指标，包括动作电位和钙处理。这是首个将诱导多能干细胞技术与心脏器械评估相结合的监管科学工具。

这种替代方法为在培养皿中评估医疗器械铺平了道路，有望减少对动物和人体试验的需求。