利用电刺激在生物导线中促进人干细胞来源心肌细胞的成熟

本实验的总体目标是利用三维可控的细胞培养方法结合电刺激，促进人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的心肌细胞的成熟。该方法有助于解答心脏组织工程领域中的关键问题，例如不同的电刺激参数或刺激时间长短如何影响心肌细胞的功能和成熟状态。最终可获得成熟度更高的工程化人源心脏组织。

该技术的应用前景涉及诊断领域，例如可用于测试新药的安全性和有效性，因为具有成熟特征（如电生理特性）的心肌细胞最有可能在药物筛选研究中作为更准确的人类心肌细胞模型。按10:1的比例混合PDMS单体与固化剂，并充分混匀。静置5分钟以去除气泡。

然后将含有生物导线模板母版的培养皿中加入PDMS混合物。尽量减少气泡的产生。接着在70°C下固化PDMS两小时。

然后，先用锋利的刀片沿边缘切割，将固化的模具取出，再将其剥离。接着修剪多余的PDMS，并将所有模板收集到灭菌袋中。在121摄氏度下通过蒸汽高压灭菌器对模板灭菌20分钟。

然后在生物安全柜的通风条件下，将每个模板放入无菌培养皿中。接着，对每个模板使用镊子将一段无菌6.0丝线缝合线沿整个通道的凹槽固定。随后模板即可用于细胞接种。

缝线将作为三维结构形成的模板，使结构沿缝线轴向排列，模拟心肌纤维的形态。为每个腔室制作一对矩形聚碳酸酯片，用作电刺激腔室的框架。在每片聚碳酸酯片的中心线上，钻两个直径三毫米的孔，两孔相距两厘米。

为每个腔室准备两根长1.5厘米的碳棒。在每根碳棒末端约3毫米处钻一个直径1毫米的孔。然后将铂丝穿过每个孔，并将铂丝的一端缠绕在碳棒上。

接下来，对于每个腔室，在两块聚碳酸酯材料之间插入两根杆，形成一个框架。然后将约两毫升的PDMS倒入六孔板的一个孔中，并将框架放入含有PDMS的孔内，使框架底部浸入PDMS中。在70°C下固化两小时，使PDMS固定框架。

然后将带有已固化PDMS的完整腔室从培养板上取下。为测试组装好的腔室功能，将铂金丝连接至电池，并使用电压表检测电流是否通过电极杆。现在将功能正常的腔室转移至灭菌袋中，在121摄氏度下进行20分钟的蒸汽灭菌，以备用于细胞培养。

制备凝胶时，先将所有凝胶组分在冰上预冷，然后在无菌离心管中混合。务必最后加入胶原蛋白和细胞外基质，并通过移液操作混合各组分。细胞为由人多能干细胞分化而来的心肌细胞。

收集细胞，并为每份生物线制备样品准备含有五十万个细胞的3.5微升胶原凝胶。现在使用P10移液枪头将约四毫升悬液加入每个培养皿中0.5厘米长的通道模具内。根据需要使用无菌镊子调整缝线位置，使其完全拉伸。

接种细胞后，每次取用前务必重新悬浮凝胶-细胞混合物，以确保结果一致。加样到通道后，用无菌 PBS 覆盖培养皿底部，注意不要触碰凝胶。这将确保生物导线在聚合过程中不会脱水。

将生物导线在37摄氏度下孵育30分钟后，用足量培养基替换PBS，以覆盖细胞，通常12毫升足够。随后培养培养皿一周，每隔一天更换一次培养基。

在生物安全柜中，向六孔板的每个孔中加入两毫升 PBS，该六孔板将用于放置电刺激装置。然后使用无菌镊子轻轻将经过高压灭菌的装置放入孔中。装置就位后，弃去 PBS，并更换为五毫升预温的培养基，确保完全覆盖碳棒。

在将细胞培养24小时之前，观察心肌细胞在电刺激下的收缩能力，以确保细胞能够接收电刺激并产生收缩反应。接着，将生物导线放入电刺激仪腔室中，并使通道垂直于碳棒排列。将铂金导线从培养板上向外延伸，然后盖上盖子。

将导线连接至电刺激器。设置刺激器以输出双相、每毫秒一次、频率为1赫兹、场强为每厘米3伏的脉冲。然后将电刺激器中的标本转移至37°C的培养箱中。

从第0天开始，以每天1赫兹的频率刺激，之后每24小时逐步增加刺激频率，至第6天达到6赫兹。在这一周的培养期间，每隔一天更换一次培养基，并每日观察心肌细胞的收缩能力。

经过七天的预培养后，细胞在生物导线中重塑了缝线周围的凝胶。细胞沿缝线轴向排列，形成取向一致的心肌组织。这些细胞表达心肌收缩蛋白，收缩装置中出现肌节带状结构，且肌原纤维沿缝线轴向排列。

生物导线中的细胞增殖速率低于类胚体中的细胞。在生物导线中培养的心肌细胞，其钙处理能力显著改善。咖啡因处理可诱导肌浆网中钙离子的突然释放。

此类瞬变仅在受到刺激的细胞中观察到。此外，钙释放的幅度也显著依赖于刺激频率。另外，与在拟胚体中培养相比，在生物导线中培养的心肌细胞表现出更佳的hERG电流和内向整流电流密度，而电刺激进一步增强了这一效应。

增强的内向整流电流与钾内向整流通道基因 KCNJ2 表达水平的升高一致。与对照生物导线相比，类胚体来源的心肌细胞的自律性（即自发搏动能力）显著更高。对照组的自律性与接受每秒六次刺激方案处理的生物导线制备物相当。一旦掌握操作流程，生物导线的制备可在半天内完成。

电刺激装置的设置需要数小时，最终结果可在两周内获得。在进行该操作时，需要注意的是，由不同细胞系或不同方案分化而来的心肌细胞在成熟度和纯度上可能会有轻微差异。因此，可能需要根据所使用的细胞优化刺激频率等实验参数。

通过该方案，可进一步优化其他条件，包括细胞组成的改变以及突变心肌细胞的应用，以回答更多相关问题。