基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

细胞外囊泡（EVs）结构复杂，难以识别其中特定的亚群，而本方案可通过其表型、尺寸分布及纳米力学特性对其进行检测。该技术组合是一种无标记方法，可实现从培养基及血液血浆中实时检测EVs。该技术能够深入表征目标纳米颗粒的亚群，既可用于病理状态的生物标志物，也可作为药物递送载体的纳米颗粒。

由于该方法非常灵敏，在注入目标样品前，必须注意生物芯片的制备。在完成芯片的包被和功能化后，将生物芯片置于含有200毫摩尔/升的乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺和50毫摩尔/升的N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，在室温避光条件下孵育至少30分钟。使用点样仪加入300纳升配体溶液，并将生物芯片置于超声水浴中孵育30分钟。

用超纯水从上方冲洗生物芯片。加入一滴与棱镜折射率相同的油，以在生物芯片和棱镜之间形成均匀的薄层，并轻轻将其放置在与生物芯片折射率相同的棱镜上。进行表面等离子体共振成像时，将生物芯片安装到SPRi系统中。

在软件左侧的下拉菜单中，点击“工作目录”。找到显示不同斑点的图像，然后点击选择该图像。接着输入配体家族的名称，点击“完成物种定义”。

使用光标将黑线拖动至最佳工作角度。点击“将镜片移至工作角度”，并选择一个工作角度。然后点击“动力学”。

当软件提示用户定义阴性对照时，此时选择“无阴性对照”。以每分钟50微升的速度注入大鼠血清白蛋白，持续4分钟。然后以每分钟20微升的速度注入乙醇胺，持续10分钟，以灭活仍存在于表面且具有反应性的羧基基团。

随后，以每分钟 50 微升的速度注入 40 毫摩尔的 OG，清洗生物芯片 4 分钟。在遵循不同位点上囊泡相互作用动力学的同时，将细胞外囊泡以特定浓度注入生物功能化的芯片上。同时测定反射率值及相互作用水平。

待其稳定后，在芯片上注入戊二醛，以固定细胞外囊泡，防止其在进行原子力显微镜成像前发生位移。将生物芯片对准玻璃载片上的掩膜顶部。利用原子力显微镜上方的CCD相机，将悬臂定位至需要扫描的正确位置。

以接触模式开始原子力显微镜（AFM）采集，从三到五个由大到小的区域进行扫描。随后，使用 JPK 数据处理软件处理 AFM 图像，首先选择高度通道。选择多项式拟合以从每条扫描线中减去，从而获得校正后的扫描线。

选择金颗粒的高度阈值以消除表面粗糙度。颗粒提取模块采用8.5纳米的高度阈值来标记颗粒。在白蛋白钝化后对多重生物芯片进行了分析。

无默认状态的芯片。存在一些缺陷的芯片，这些缺陷由斑点融合、接枝弱化、气泡或污染物引起。同时展示了一个无微阵列的裸金芯片，用于检测细胞外囊泡在金表面的吸附情况。

在多重生物芯片上的捕获实验显示出不同配体具有良好的反射信号，且不同配体的信噪比较高，因为阴性对照的响应可忽略不计。细胞外囊泡样品注入后，细胞外囊泡在芯片上的吸附表现出高反射信号，表明这些囊泡能够吸附并稳定地停留在金芯片表面。在加载细胞外囊泡后，获得了生物芯片上细胞外囊泡的大尺度和小尺度原子力显微镜（AFM）图像。

高分辨率的近距离视图可实现对细胞外囊泡的计量分析。生物芯片上细胞外囊泡的有效直径范围为 30 至 300 纳米，其中大多数集中在 60 纳米左右。在空气和液体中获得的结果具有可比性。

裸芯片上吸附的细胞外囊泡的拉曼光谱显示出清晰的谱图，其峰位主要对应于与细胞外囊泡膜脂质相关的亚甲基振动。为了能够准确且可重复地检测您的细胞外囊泡（EVs），必须严格制备您的生物芯片。可采用蛋白质印迹（Western blotting）和纳米颗粒追踪分析等常规方法，以关联并验证表型和粒径分布模式。

此外，多组学分析有望进一步深入外泌体的分子表征，并实现潜在亚群的区分。