探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

我们采用表面增强拉曼散射结合机器学习技术，以应对癌症早期诊断的挑战，并推动生物医学应用的发展。一个关键的实验难点在于外泌体样本固有的异质性，以及高度复杂、高维度的光谱数据，而低信噪比进一步加剧了这一问题。首先，用移液器吸取约五微升的小细胞外囊泡样本，滴加到指定的等离子体基底上。

将基底放入干燥器中，使液滴完全干燥，约需15分钟。然后将干燥的基底转移至共聚焦拉曼显微镜。使用仪器配套软件WiRE 4.4版本，开始数据采集。

将激发激光器设置为785纳米，功率为五毫瓦，并对系统进行校准。为从金基底获取光谱，在300乘以300微米的区域内进行探查扫描，使用静态模式，步长为10微米，曝光时间为0.1秒，激光功率为50%，以定位单个囊泡。找到囊泡后，在5乘以5的网格区域内进行高分辨率映射，采用静态模式，步长为1微米，每点曝光时间为0.2秒，激光功率为50%。

接下来，通过执行以下扫描步骤从石墨烯基底获取光谱。筛选初始的原始光谱，排除任何显示过度噪声或异常光谱形状的光谱。对每条光谱应用Savitsky-Golay滤波器，以降低荧光背景并平滑光谱数据。

使用峰-基线法或标准偏差法计算每个光谱的信噪比。对于每个光谱，将信噪比计算为在代表性拉曼谱带处基线扣除后的峰强度与噪声标准偏差的比值。通过从原始光谱中减去Savitsky-Golay平滑后的光谱来估计噪声，平滑时采用11点窗口宽度和三次多项式阶数。

将所有光谱按信噪比升序排列，并评估诊断峰在排序后光谱中的持续性，以确定阈值。然后将阈值设定在任一这些峰消失于基线噪声的位置，该位置对应的信噪比为28。排除信噪比低于28阈值的光谱，以确保仅保留高质量光谱用于后续分析。

将每个剩余的光谱归一化为其最大峰强度或曲线下的总面积。根据光谱数据的来源为其分配标签，例如胃癌患者或健康对照。将带有标签的光谱数据输入具有线性核的支持向量分类器，并应用分层随机划分进行五折交叉验证，以确保每一折中各类别样本的均衡代表。

现在，对所有折的准确率指标进行平均，以评估模型的整体性能。最后，使用线性判别分析（LDA）降低表面增强拉曼散射数据集的维度，以便进行可视化。利用训练好的线性判别分析模型，在样本组之间进行直接分类。

来自组织、血液和唾液样本中分离的单个小细胞外囊泡的拉曼光谱及其相应的平均光谱，显示出每种样本类型的独特分子特征。线性判别分析显示，根据来源不同，细胞外囊泡数据在组织、血液或唾液之间呈现出明显的聚类。使用支持向量机分类器进行二分类时，组织样本的准确率最高，达到90.1%，其次是血液样本为70.9%，唾液样本为60.7%。基于LDA的分类方法在组织来源的细胞外囊泡数据中清晰地区分了健康样本与胃癌样本。

基于LDA的血液和唾液来源细胞外囊泡数据分类结果显示，健康样本与癌症样本之间的分离效果较差。未添加石墨烯的阿霉素孵育囊泡的拉曼光谱在约1,081、1,206和1,440 cm⁻¹处显示出稳定的特征峰。加入石墨烯后，在约1,350 cm⁻¹处出现额外的D峰，并在约1,580 cm⁻¹处观察到G峰，可作为内部标准。

阿霉素在442 cm⁻¹处的峰与石墨烯G峰的比值随着药物浓度的升高和孵育时间的延长而增加。我们建立了一种单囊泡生化指纹图谱技术，可用于区分疾病来源，具有早期诊断的潜力。本技术具有三个关键优势。

第一，它具有高灵敏度；第二，它具有非侵入性；第三，它不需要裂解或物理破坏颗粒。

未来，我们将把光谱特征与蛋白质组学特征相关联，进而有助于将外显子内容与特定功能（如细胞通讯和物质运输）相关联。