一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

基于图像流的微核检测法可克服自动显微镜和传统流式细胞术等方法的多种局限性，包括通量低以及缺乏对事件的可视化确认。该技术的主要优势在于，所有用于确定遗传毒性和细胞毒性的关键事件均可被自动成像、识别和计分，无需制备显微镜载玻片。在细胞暴露于断裂剂和/或非整倍体诱导剂时，向T25培养瓶中九毫升适宜的细胞培养基内含有七至八乘以十的五次方个实验细胞的体系中加入一毫摩尔的目标化学物质，向对照组培养物中加入一毫升水。

将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时，然后将细胞转移至每瓶对应的一个15毫升聚丙烯管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管10毫升新鲜培养基中，接种至新的T25培养瓶中。随后，向每瓶中加入150微升细胞松弛素B储备液，使其终浓度为每毫升3微克。

将培养瓶放回培养箱中，恢复培养时间应为1.5至2个倍增时间，具体时长参照经济合作与发展组织（OECD）指南建议。恢复培养结束后，将培养物分别转移至15毫升聚丙烯离心管中进行离心，并用5毫升75毫摩尔/升氯化钾重悬沉淀。轻轻倒置混匀3次，于4摄氏度孵育7分钟。

孵育结束后，向每个样品中加入2毫升4%的甲醛，轻轻颠倒混匀3次。将样品放回4°C环境中10分钟，然后通过离心收集细胞。将沉淀重悬于100微升新鲜的4%甲醛中，孵育20分钟。

孵育结束后，每管加入5毫升洗涤缓冲液，通过离心洗涤固定后的细胞，并将沉淀重悬于每管100微升洗涤缓冲液中。接着，将样品转移至各自的1.5毫升微量离心管中，用于血细胞计数板计数。每管中，向每毫升含1.0 × 10⁶个细胞的样品加入5微升浓度为100微克/毫升的Hoechst 33342，以及每100微升样品加入10微升浓度为500微克/毫升的RNase。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟后，将样品在微量离心机中离心，并从每根试管中弃去上清液，仅保留30微升。然后小心地重悬样品，注意避免产生气泡。若重悬过程中出现气泡，可轻轻弹击试管以去除气泡。

进行多光谱成像流式细胞术检测样品时，首先打开 405 纳米激光器，并将激光功率设置为 10 毫瓦。关闭所有其他激光器，包括侧向散射激光器，并将明场设置为通道一和通道九。确认放大倍数滑块已设置为 60 倍，已选择高灵敏度模式，并且图像库中仅显示通道一、七和九。

单击散点图，选择所有群体，并将 M01 的面积设为 X 轴。将 M01 的宽高比设为 Y 轴，单击方形区域，在单个细胞周围绘制一个区域。将该区域命名为“单个细胞”，然后在图上右键单击以选择区域。

圈选单细胞区域，将X坐标设置为100和900，Y坐标设置为0.75和1。设置采集参数，并指定文件名和目标文件夹。然后将采集事件数更改为20,000，选择DNA阳性细胞群，运行第一个样本。

要在 IDEAS 中打开数据文件，请单击“开始分析”以启动“打开文件向导”，然后浏览并选择所需的原始图像文件。接着单击“下一步”，在图像库中查找双核细胞。要创建掩膜，请单击选择目标图像，然后打开分析选项卡。

单击“Masks”（掩膜）、“New”（新建）和“Function”（功能）以选择 LevelSet。在“Mask”（掩膜）下，选择 M07 和 Middle Level Mask，并将轮廓细节尺度设置为 3。然后单击两次“OK”（确定）。

为了检测双核细胞的斑点数量，打开“分析”选项卡，选择“特征”和“新建”。在“特征类型”中选择“斑点计数”；在“掩膜”中选择最终的双核细胞掩膜，并将连通性设置为四，然后将名称更改为“Spot Count BNC”，点击“确定”并关闭以计算特征值。

对于微核计数双核细胞直方图，点击直方图并选择非凋亡细胞作为父代群体。X轴参数选择微核计数双核细胞（Spot Count BNC），点击确定和线性区域，然后在Bim Two区域横跨绘制一个区域，并将该区域命名为2N。要创建微核掩膜，请从图像库中选择一个含有微核的双核细胞，然后在分析选项卡中打开掩膜功能。

要创建一个斑点识别掩膜，请点击“新建”和“函数”，然后选择“斑点”。确认已选中“亮”单选按钮，并在掩膜下选择 M07。将“斑点与细胞背景比值”设置为 2，最小半径设置为 2，最大半径设置为 6。

单击“确定”，然后再次单击“确定”以将掩膜添加到左侧列表中，接着单击“新建”以创建另一个掩膜。单击“Spot M07 Channel seven Bright two six two”掩膜，然后单击向下箭头将其添加到掩膜定义中，并单击“And”和“Not”运算符。单击向下箭头，将扩张范围掩膜添加到掩膜定义中。

要创建多核群体掩膜，请点击分析、掩膜、新建、函数。在函数下选择范围。在掩膜下选择Watershed Dilate Set M07 Channel07、中间、三、二，并将显示图像设置为Channel 07。

将面积的最小值和最大值分别设置为 135 和 5000，将长宽比的最小值和最大值分别设置为 0.4 和 1。点击“确定”，在名称字段中将文本更改为 POLY mask，然后点击“确定”和“关闭”。要创建自定义视图，请点击“图像库属性”按钮，打开“复合图像”选项卡，然后点击“新建”。

在“名称”下，输入通道 01 至通道 07。单击“添加图像”，在“图像”下选择通道 01，并将百分比设置为 100。再次单击“添加图像”，在“图像”下选择通道 07，并将百分比设置为 100。

单击“查看”选项卡，单击“新建”，在“名称”下输入 BNC 和 MN 掩膜。然后单击“添加列”，在“图像类型”下选择通道 01，在“掩膜”下选择“无”。单击“添加列”，在“图像类型”下选择通道 07，在“掩膜”下选择“无”。

单击“添加列”，然后单击“复合”单选按钮，再单击“确定”以完成自定义视图。单击“视图”下拉菜单，选择“BNC和MN掩模”视图。单击“显示/隐藏掩模”按钮。

为了列举关键事件，请打开“报告”选项卡，点击“定义统计报告”，然后在新窗口中点击“添加列”。要添加双核细胞计数的统计项，在“统计”下选择“计数”，在“选定群体”下选择BNC群体，然后点击“添加统计”以将该统计项加入列表并保存模板。当所有统计项均已添加至列表后，点击“关闭”，然后点击“确定”，最后保存数据分析模板。

为了批量处理实验文件，在“工具”菜单下，单击“批量数据文件”，然后在新窗口中单击“添加批量”。单击“添加文件”以选择要加入批量处理的实验文件，然后在“选择模板或数据分析文件”选项下，单击“打开文件夹”按钮。浏览至刚刚保存的模板并将其打开。

单击“确定”以关闭当前窗口，然后单击“提交批次”以开始对所有文件进行批量处理。此处显示了用于识别双核细胞的四个选定面板。

这些双变量图和直方图可用于选择双核细胞，并识别出具有相似圆度、面积和强度且彼此分离良好的双核细胞。明场和Hoechst图像，以及双核细胞和微核的掩膜，有助于双核细胞和微核的识别与计数。应用点计数功能时，利用多核掩膜来识别单核、三核和四核细胞。

然后将三核和四核细胞的数量相加，得到用于计算细胞毒性的最终多核细胞数量。此处展示了内源性秋水仙素、断裂剂丝裂霉素C以及阴性对照甘露醇的代表性遗传毒性和细胞毒性数值，以证明该方案的有效性。使用适当浓度的DNA染料对细胞进行标记至关重要，可确保获得高质量的图像，从而便于清晰识别和计分所有关键事件。

这些技术还可应用于辐射生物剂量学中的微核试验，从而对可能受到辐射暴露的个体进行剂量估算。