通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

这种具有生理相关性的自发自身反应性生发中心嵌合模型，能够将体内细胞定位与下游分子分析相联系。该自身反应性生发中心混合嵌合模型的主要优势在于其多功能性和边缘特性，可用来研究几乎所有期望的细胞亚群或分子通路。此自身免疫性疾病发展模型具备的生理相关性，有助于获得新的认识，可能推动新型疗法的开发。

这种骨髓嵌合体模型可用于免疫学、免疫肿瘤学和干细胞研究。光激活组分具有广泛的应用性，因为它将组织定位与下游细胞分析联系起来。骨髓制备与重建、体内标记以及组织外植等步骤均为技术上较为复杂的操作，非常适合通过可视化演示进行展示。

为了提取供体564Igi小鼠的股骨和胫骨，先去除一条后肢的皮肤，用力拉脚使膝关节和踝关节脱位。接着，折断踝关节。然后，在固定胫骨的同时将脚向身体方向拉动，从而剥离附着在胫骨上的肌腱和肌肉。

折断膝关节以分离胫骨，同时握住股骨将骨向身体方向拉动，以剥离股骨上的肌腱和肌肉。随后，在髋关节处做一切口，切断肌腱后将股骨从髋臼中抽出。以类似方式去除对侧后肢骨骼后，用粗糙的纸巾轻轻擦拭骨骼，以去除残留的肌肉和结缔组织，并将剥离干净的骨骼用预冷的骨髓缓冲液冲洗。

然后，使用Dumont 7号镊子将骨骼转移至盛有预冷骨髓缓冲液的容器中，置于冰上。为提取骨髓细胞，先用冰冻的骨髓缓冲液冲洗研钵，再用10毫升血清移液管将冲洗液替换为10毫升新鲜的冰冻骨髓缓冲液。用镊子将骨骼转移至研钵中，用研杵碾压并研磨骨骼，以释放骨髓细胞。

使用10毫升移液管收集骨髓提取物，然后将骨髓溶液通过70微米细胞滤筛，滤入置于冰上的50毫升锥形管中。随后，用额外10毫升新鲜的冰冻骨髓缓冲液冲洗研钵，以确保细胞的完全回收。为制备供体悬液，将适量的光激活型GFP和564Igi供体骨髓混合于50毫升锥形管中，并通过离心沉淀细胞。

将混合的细胞沉淀重悬于冰上预冷的骨髓缓冲液中，浓度为每毫升含一乘以十的八次方个细胞，并将细胞转移至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。接着，确认麻醉后的CD45.1受体小鼠对脚趾夹捏无反应，并轻轻弹击供体骨髓细胞管，以确保细胞充分重悬。将200微升骨髓混合液吸入一支0.3毫升、30号针头的胰岛素注射器中，将受体小鼠侧放，轻柔地拉伸眼周上下方的皮肤，使眼球轻微突出。

将注射器针尖以约30度角小心插入眼眶前部，注意避开眼球及周围组织。当针尖触及眼眶下方的骨骼时，先将针头回撤约0.5毫米，然后施加稳定压力，缓慢注入供体骨髓。随后，将小鼠放回笼中，自由饮用含抗生素的水，并持续监测直至完全恢复。

为了标记腘窝淋巴结，将2微升藻红蛋白标记的抗小鼠CD169大鼠抗体加入18微升磷酸盐缓冲液中稀释，然后将10微升抗体溶液滴加两滴于一片塑料石蜡膜上。用一支0.3毫升胰岛素注射器（带30号针头）吸取每滴抗体溶液，向麻醉后的受体动物足垫内注射10微升抗体。在采集淋巴结前，将一方形盖玻片置于平坦表面，并用装有真空脂的5毫升注射器沿盖玻片边缘涂抹一圈油脂，距离各边缘约1至2毫米。

将腔室转移至冰冷的平坦表面，并用冰冻的骨髓缓冲液填充真空润滑脂腔室。为了获取腘淋巴结，使用直的精细剪刀在已处死受体动物膝窝下方的皮肤处做一切口，并沿腿后肌线向上延伸切口，直至接近髋关节。使用Dumont 5号或7号镊子将暴露的皮肤瓣向外牵拉，以显露腘窝区域的组织，并用镊子小心地从腘静脉内侧进入腘窝。

沿腿部轴线开合镊子，暴露其下方的腘窝淋巴结，然后用拇指和食指从膝关节前方近端捏住股四头肌，使淋巴结从窝中弹出。将镊子滑至淋巴结下方，将其从周围组织中分离，并放入真空油脂腔内。收集第二个淋巴结后，将第二张盖玻片置于真空油脂环上，轻轻按压以闭合腔室，注意挤出所有气泡。

为了鉴定收获的脾组织样本中的生发中心，将成像腔室置于双光子荧光显微镜的载物台上，并使用3.5毫升塑料移液管在上层盖玻片表面滴加一滴蒸馏水。降低物镜直至接触点，利用透射光对准组织表面进行聚焦。切换至暗场模式并启用双光子激发，将激光调谐至940纳米。

在组织表面附近，找到由 CD169 染色界定的独立白髓区域，并通过与中央小动脉相关的二次谐波信号识别动脉周围淋巴鞘。在动脉周围淋巴鞘与边缘区之间的区域，识别出具有强自发荧光的活化吞噬细胞样巨噬细胞的存在，并利用这些解剖标志，在单个生发中心区域周围绘制一个感兴趣区域。随后，从组织表面开始，设置深度约为 100 至 150 微米的 Z 轴层扫，步长约为 3 微米，然后切换至 830 纳米的激发波长。

关闭或调暗所有通道以防止探测器受到光损伤，并对图像层进行成像。随后切换回 940 纳米的激发波长，重新打开通道，扫描整个图像层以确认光激活效率良好，并确保在整个图像层中无光损伤现象。混合骨髓嵌合体的血清型分析显示，在重建后六周 B 细胞数量恢复正常，其中来自 564Igi 区室的 9D11 阳性循环 B 细胞频率较低。

在全部淋巴细胞门控范围内，残留的受体来源细胞频率较低，其中约6%为CD45.1来源，表明总体嵌合程度约为94%。B细胞区室几乎完全嵌合，并以光激活型GFP骨髓来源的B细胞为主，这是由于564Igi来源的B细胞经历了强烈的阴性选择所致。如观察所示，使用CD169进行体内标记可有效可视化边缘区。二次谐波信号出现在含胶原的结构成分和主要血管中，包括动脉周围淋巴鞘的中央小动脉，以及与生发中心活动相关的具有强自发荧光的活化吞噬性巨噬细胞。

综上所述，这些数据可用于确定一个可能包含单个光激活生发中心的兴趣区域。后续的流式细胞术分析进一步证实了归一化的B细胞区室数量、自发形成的生发中心细胞群，以及一部分被光激活的生发中心B细胞的存在。为确保足够的细胞活力，必须将组织取出、光激活及组织处理等步骤的总周转时间控制在4至6小时之内。

光激活的细胞可通过流式分选并进行单细胞测序，例如用于表征单个生发中心的B细胞受体库。混合嵌合体模型使得对自身反应性生发中心生物学的研究达到了新的深度，例如揭示了表位扩散过程的展开机制。需要注意的是，双光子显微镜所用的光源为高功率脉冲四类激光器，可能对眼睛造成严重损伤。