通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

该方法有助于回答自身免疫研究领域中的问题，例如识别自身免疫性疾病背景下细胞频率的异常以及功能差异（如关键细胞因子的产生）。该方法的主要优势在于，能够从易于获取的外周血样本中，同时捕获广泛的细胞谱系或不同细胞类型及其功能差异。通常，初次接触该技术的研究人员可能在血液处理步骤的时间控制、抗体组合设计、条形码标记过程以及高维单细胞数据的分析方面遇到困难。

这种系统免疫学方法特别适用于系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病，因为在这些疾病中，免疫失调广泛存在，并在外周血中表现明显。对该方法进行可视化演示，有助于明确各步骤的时间节点，同时展示在进行质谱流式细胞术分析之前，如何对多个样本进行条形码标记并混合。开始此操作时，将用于全血处理的五种不同条件的已标记圆底聚苯乙烯管放置在试管架上。

接下来，向每根试管中加入 1 毫升 37 摄氏度的 RPMI 培养基。然后，向每根试管中加入 1 毫升全血，并上下吹打数次，以与 RPMI 充分混匀。随后，向标记为 T6+5R 的试管中加入 10 微升预稀释的芦可替尼，并充分混匀。

将试管架放入37摄氏度的培养箱中，并开始计时孵育。处理T零样本时，用移液器将T零管中的全部内容物转移至含有20毫升工作浓度37摄氏度裂解/固定缓冲液的已标记锥形管中。为优化细胞回收率，用裂解/固定缓冲液冲洗试管，并通过倒置锥形管混合。

将细胞在37摄氏度下孵育15分钟，以实现裂解和固定。随后，在室温下以500 × g离心5分钟。之后，倾去上清液，并将细胞重悬于1毫升预冷的PBS中，以充分分散细胞沉淀。

然后，用 PBS 将锥形管补至 15 毫升体积。随后，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。用 1 毫升 CSM 重悬细胞，以充分分散沉淀。

然后，将样品转移至已标记的微量离心管中，用于抗体染色。使用自动细胞计数器，取10 µL样品对细胞进行计数。接着，在室温下以500 ×g离心5分钟。

随后，吸走上清液，使沉淀物中残留约 60 微升液体。将该沉淀物置于冰上，直至其他条件的样品完成处理。在 T 等于 30 分钟时，将试管架转移至组织培养操作台。

向 T6 加 R848 管中加入 10 微升浓度为 0.1 克/微升的 R848，并充分混匀。然后，向 T6 加 LPS 管中加入 10 微升浓度为 0.01 微克/微升的 LPS，并充分混匀。随后，向标记为 T6、T6 加 5R 以及 T6 加 LPS 的管中各加入 4 微升蛋白转运抑制剂，并将样品放回培养箱，直至反应时间达到 6 小时。

每两小时使用 P1000 移液器将样品充分混匀。在 T 等于 2 小时时，向 T6+R848 管中加入 4 微升蛋白质转运抑制剂混合液。混匀所有样品，并将试管架放回培养箱中，直至 T 等于 6 小时。

在 T 等于 4 小时时，使用 P1000 移液器将样品再混匀一次。在 T 等于 6 小时时，按照 T 零样品的处理方法，处理 T6、T6 加 LPS、T6 加 R848 以及 T6 加五聚体 R 血样管。然后，将沉淀物保存在残留的 CSM 体积中，并于 -80 °C 下储存以备后续处理。

为了对裂解并固定的细胞进行条形码标记，将样品从零下80摄氏度的储存条件下缓慢地在冰上解冻。用PBS将10倍浓度的条形码透化缓冲液按1:10稀释，并配制足够每份样品3毫升的缓冲液。取一个非无菌槽加入CSM，另一个加入1倍浓度的条形码透化缓冲液。

然后，向 freshly thawed 样品中加入一毫升冰冻的 CSM，充分混匀，并转移至相应预标记的聚丙烯簇管中。取十微升样品，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。通过去除多余细胞的体积，对每个簇管中的细胞数量进行归一化处理。

然后，在室温下以600 × g离心细胞5分钟。使用多通道移液器将细胞重悬于1毫升1×条形码通透缓冲液中，并在室温下以600 × g再次离心5分钟。随后，吸除上清液。

将簇管按照条形码对照表上所示的相同顺序排列在试管架上，以确保样本与其条形码相对应。使用多通道移液器向所有簇管中的样本加入800微升的一种X条形码通透缓冲液，注意不要触碰细胞沉淀，以减少细胞损失。然后将装有簇管的试管架置于一旁备用。

从负20摄氏度取出20重钯条形码试剂盒的管条，在室温下解冻。加入100微升的一种X条形码通透缓冲液，充分混匀，然后将120微升重悬的条形码混合液转移至簇管中对应的细胞样品中。使用多通道移液器充分混匀，确保各单独条形码样品之间无交叉污染。

将分选管在室温下孵育30分钟，使条形码标记细胞。30分钟后，在室温下以600 × g离心5分钟。吸除上清液，然后将沉淀重悬于1 mL CSM中。

随后，离心并再次用CSM重悬。然后在室温下以600 × g离心5分钟，吸除上清液。使用同一枪头，通过单通道移液器将所有细胞沉淀连同约70至80微升的残留液体转移至一个聚苯乙烯管中。

不要弹出移液器吸头。将带有此吸头的单通道移液器放置一旁。使用多通道移液器及新的吸头，向每个原始细胞簇管中加入 100 µL CSM，以最大化细胞回收率。

使用之前预留的带吸头的单通道移液器，将所有细胞沉淀连同100微升残留液体转移至同一个聚苯乙烯管中。加入CSM培养基，使聚苯乙烯管中的总体积补至约3毫升。计数并记录混合条形码细胞组的细胞数量。

然后，在室温下以600 × g离心5分钟，并吸除上清液。在同一天内继续对带有条形码的样本进行染色。该示意图展示了外周血样本的刺激与处理流程，包括血液样本分装、刺激剂、蛋白质转运抑制剂混合物的添加时间点，以及直至红细胞裂解和固定前的孵育时间。

刺激剂的选择取决于所要评估的信号通路和细胞因子通路。固定并裂解红细胞后，来自健康供体的各个裂解并固定的细胞样本进行条形码标记，用26种针对表面标志物的抗体标记，透化后用14种针对细胞因子的抗体进行染色。此处展示的是用于鉴定CD14高表达单核细胞的简化设门策略。

从左到右，每个二维图代表来自父代群体的一个子集，该子集是通过左侧相邻二维图的设门分析得到的。以CD14高表达单核细胞为例，在八个免疫细胞亚群中，对健康供者在零时间点未刺激以及经TLR激动剂LPS和R848及T细胞激活剂PMA-离子霉素刺激后的外周血样本进行了质谱流式细胞术分析。图中展示了CD14高表达单核细胞中细胞因子诱导表达的一个示例，并显示了针对所用刺激剂具有特异性的部分细胞因子。

R848 可选择性地在 CD14 高表达的单核细胞中诱导 IL-12p40 亚基和 MCP1 的产生，而 LPS 则不能。相反，PMA 离子霉素不能在 CD14 高表达的单核细胞中诱导细胞因子的产生。一旦掌握，血液刺激实验约需七小时完成，条形码标记步骤则仅需约一小时即可完成。

在进行该实验操作时，需特别注意各步骤的时间安排，并提前做好相应规划。一旦掌握了该操作流程，便可考虑调整质谱流式面板中的血液刺激条件，以评估与您自身研究目标相关的特异性免疫细胞反应。观看本视频后，您应能够充分理解如何从全血样本中诱导细胞因子反应，以及如何将多个样本合并为一组带有条形码的样本集，用于质谱流式分析。