使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

通过检测不同组织和时间点的蛋白质表达，本方案可用于解决基础和临床研究中的重要问题。为了进行可靠的定量 Western 印迹分析，我们将荧光总蛋白染色与内参上样对照相结合，从而克服了在不同实验条件下比较多种组织时所出现的局限性。

为了从速冻的细胞或组织样本中提取蛋白质，根据表格中的说明，将 -80 摄氏度保存的样本在冰上解冻，然后对样本进行适当的洗涤。使用带有聚丙烯研杵的手持式电动匀浆器匀浆洗涤后的样本，在样品之间用双蒸水冲洗研杵，并用干净的纸巾擦干。将样本置于冰上静置 10 分钟，随后进行离心。

然后，将含有蛋白样品的上清液转移至冰上新的离心管中，注意不要扰动沉淀。为定量蛋白浓度，用牛血清白蛋白配制浓度递增的标准品，每种浓度设三个复孔，并将每个蛋白样品各取一微升，重复两份加入96孔光学板的相应孔中。若预期蛋白浓度较低，可将蛋白样品在60摄氏度的加热块上孵育10分钟或更长时间，随后使用酶标仪在560纳米波长处测定吸光度。

导出酶标仪的测量结果，并通过将各样品的平均吸光度值与使用蛋白质标准品获得的标准曲线进行比较，计算蛋白质浓度。为标准化蛋白上样量，用样品缓冲液和超纯水对蛋白质样品进行稀释，然后在70°C的加热块中孵育10分钟。随后将样品置于冰上，再进行涡旋振荡和短暂离心。

进行电泳时，将一块预制的4%至12% Bis-Tris梯度凝胶安装在凝胶电泳装置系统中，并在加样孔中加入3.5微升蛋白质标准品。若使用内参标准进行膜间归一化，需在蛋白标准品条带旁的前三个加样孔中加入与其他样品等量的样品，其余加样孔中每孔加入30微克样品。随后，先以80伏电压运行样品通过浓缩胶10分钟，再以150伏电压继续电泳45至60分钟。

电泳结束后，开始组装转膜装置：将蛋白凝胶放置在底部支架上，底部支架包含聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），其上再放置滤纸。使用转膜滚轮去除所有气泡，然后将上层支架置于滤纸上方，再次滚动以彻底去除气泡。将整个装置转移至转膜槽中，确保装置左侧与电极对齐，并将凝胶海绵放置在装置顶部，使海绵与设备上的相应电极接触点对齐。

关闭盖子后，选择并启动相应的程序。程序结束后，将膜裁剪至与凝胶大小一致，并用双蒸水快速清洗裁剪好的膜，随后进行总蛋白染色。进行总蛋白染色时，将膜卷成筒状放入50毫升离心管中，使蛋白面朝向内侧，在通风橱中加入5毫升蛋白染色液，于室温下在摇床上孵育5分钟。

孵育结束后，用5毫升洗涤液快速洗涤膜，在每次洗涤间隙将管短暂放回滚轴仪上，随后用超纯水短暂漂洗。向膜中加入3毫升封闭缓冲液，并将膜置于滚轴仪上室温孵育30分钟。弃去封闭缓冲液，加入适当优化浓度的目标一抗，于4摄氏度在滚轴仪上孵育过夜。

第二天，在室温下用滚轴装置，每次加入5毫升新鲜PBS，共洗涤膜6次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将膜置于滚轴装置上，加入相应的二抗溶液，室温孵育1小时，随后进行3次洗涤，每次30分钟。最后一次洗涤后，将膜干燥，并用铝箔包裹以避光保存。

进行图像采集时，将膜放置在扫描仪上，使蛋白质面朝下，并在软件中选择扫描区域。随后，在两个通道中采集图像，并将图像导出至合适的图像分析程序。显示700纳米通道以展示总蛋白染色结果，选择“分析”功能并绘制矩形，以定义用于归一化的感兴趣区域。

然后，将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的样品上，以确保所有分析条带的定义区域大小相同。为了定量每条带中的蛋白质浓度，将总蛋白染色和目标蛋白的结果复制到电子表格程序中，并确定最高的总蛋白染色信号值。接着，用每个总蛋白染色信号值除以该最大值，得到归一化的蛋白上样量；再将每个样品的800纳米信号值除以其对应的归一化蛋白值，以计算不同样品中目标蛋白的相对表达比率。

在这些具有代表性的 Western 印迹图中，比较了从出生后第五天小鼠组织中提取的蛋白质与从 10 周龄成年小鼠组织中提取的蛋白质。通过测量每条泳道中矩形框内的荧光强度，实现了对总蛋白染色荧光强度的定量分析。当对整条泳道进行分析时，各样本间的荧光强度相对接近，表明使用总蛋白染色进行归一化适用于此目的。

荧光总蛋白染色也可用于比较不同发育时间点的蛋白水平。例如，尽管小鼠中存活运动神经元蛋白水平随年龄增长而明显下降，但总蛋白染色的定量结果保持恒定。使用内参标准、基于荧光的归一化方法以及适当的统计分析，可增强在不同条件下进行复杂蛋白表达分析的可靠性。

本方案在传统蛋白质印迹技术的基础上进行了改进，克服了实验批次间内参蛋白选择与比较的难题，并为蛋白质表达分析提供了更大的灵活性。该方法可进一步扩展应用于其他实验条件下蛋白质表达水平的比较。