通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本实验的总体目标是鉴定并准确定量不同药物处理、时间过程或生物学条件下细胞或组织裂解液中超过 10,000 种蛋白质。该方法有助于回答医学或生物学领域中的关键问题，例如哪些蛋白质在药物或其他生物学刺激作用下发生变化。该技术的主要优势在于，能够在 10 种不同的实验条件下，对超过 70% 的表达蛋白组进行准确定量。

该技术的应用可拓展至通过潜在生物标志物的发现来诊断人类疾病。直观展示该方法至关重要，因为最佳的细胞裂解和液体估算是后续消化、标记和分离步骤成功的关键。开始本方案前，需获取目标培养细胞。

用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤使用 10 毫升 PBS。用刮刀刮下细胞，并将洗涤后的细胞收集至含有 1 毫升 PBS 的 1.5 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下以 600 × g 离心 5 分钟。

移除上清液，并在-80°C下保存，直至准备裂解细胞。解剖后应迅速收集并称量所需组织。随后立即将其置于液氮中，并在-80°C下保存。

按照文本方案中的说明，在实验当天配制裂解缓冲液。将裂解缓冲液加入冷冻样品中，使缓冲液与样品的比例为10:1，最终蛋白浓度为每毫升5至10毫克。接着加入玻璃珠，使用匀浆器在4°C、速度8的条件下裂解样品，每次匀浆30秒，随后暂停5秒，重复此过程5次，或直至样品完全均质化。

使用标准蛋白定量分析法或以 BSA 作为标准品的考马斯亮蓝染色 SDS 聚丙烯酰胺凝胶测定蛋白浓度。随后加入 100% 乙腈，使终浓度为 10%，并加入 Lys-C 蛋白酶，使其酶与底物的比例为 1:100。室温孵育两小时，以完成蛋白质消化。

然后加入DTT，使其终浓度为1毫摩尔。在室温下孵育1小时。接着加入50毫摩尔HEPES，使样品中的尿素浓度稀释至2摩尔。

按胰蛋白酶与蛋白质1:50的比例向每个样品中加入胰蛋白酶。室温孵育至少三小时。接着，加入DTT至其浓度再次达到1毫摩尔，并在室温下孵育两小时。

加入碘乙酰胺，使其终浓度为 10 毫摩尔/升。室温下避光孵育 30 分钟。随后，加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为 30 毫摩尔/升，以淬灭未反应的碘乙酰胺。

室温孵育30分钟。按照文本方案中所述检查胰蛋白酶消化的效率。随后，向每个样品中加入三氟乙酸（TFA），使其终浓度为1%。使用pH试纸测定每个样品的pH值，确认其在2至3之间。

如有需要，逐滴加入额外的三氟乙酸（TFA）以达到不理想的 pH 值。在室温下，以 20,000 × g 离心样品 10 分钟。收集上清液，并将样品加载至预先准备好的离心柱中。

在100 × g条件下离心三分钟，或直至样品完全通过层析柱，以实现样品的结合。随后，向每根层析柱中加入0.5毫升0.1%三氟乙酸（TFA）。在500 × g条件下离心30秒。

此后，向每个柱中加入 125 微升含有 60% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的溶液。以 100 × g 离心 3 分钟，将肽段从柱上洗脱下来。将每个脱盐后的肽段样品重新溶解于 50 微升 50 毫摩尔的 HEPES 溶液中。

使用 pH 试纸确认每个样品的 pH 值在 7 到 8 之间。接下来，将 TMT 试剂溶解于无水乙腈中，加入样品，然后在室温下孵育 1 小时。之后，使用嵌入色谱介质的 10 微升移液器吸头对每个样品的 1 微克进行脱盐，并按照文本方案中所述分析标记效率。

检测六至十个不同的肽段，以确保在标记样本中未检测到未标记的肽段。然后，将每个样本约两微升混合在一起。使用嵌入色谱介质的10微升移液器吸头对此混合物进行脱盐处理。

按照文本方案中所述，通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析样品。首先，将脱盐后的TMT标记肽段混合样品溶于65 µL缓冲液A中。使用pH试纸确认pH值约为8.0。如果样品仍呈酸性，可根据需要使用氢氧化铵调节pH值。

接下来，按照文本方案中所述对样品进行分级分离。将馏分收集器设置为每两分钟收集一次馏分（包括上样时间），流速设置为 0.4 毫升每分钟。

共收集80个组分。然后，使用真空浓缩仪将每隔一个的样品完全干燥。利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析全部80个组分，以实现超深度的蛋白质组覆盖。

首先，将1.9微米C18树脂填充至内径为75微米的空柱中，使柱床体积达到约1.3微升。将色谱柱在蝴蝶式加热器内盘绕两到三圈，以确保整根色谱柱均匀受热。用胶带将色谱柱固定在加热器内部，注意不要遮盖加热器的温度传感器。

然后，将色谱柱加热至 65 摄氏度。将 100 纳克大鼠脑肽样品注入 LC-MS/MS 系统，以评估系统性能。重复此评估过程一次。

此后，在流过 5% 缓冲液 A 的同时，将约 0.2 微克的重组肽上样至色谱柱。洗脱肽段并按照文本方案所述使用质谱仪进行分析。本研究描述了一种采用 10 重等压标记策略对蛋白质进行高通量定量的方法。通过 LC-MS/MS 分析 TMT 标记的样品及相应的未标记样品，以检测 TMT 标记效率。

可以看出，未标记的肽段峰仅出现在未标记的样品中，而TMT标记的肽段峰仅出现在标记的样品中。接下来评估MS2隔离窗口对干扰的影响。所有MS2扫描均被归类为干净扫描或噪声扫描。

尽管干净的谱图仅显示赖氨酸的y1离子，但噪声谱图中赖氨酸和精氨酸均出现y1离子。此处展示了利用分别标记三种不同TMT试剂的大肠杆菌肽段进行代表性干扰去除的结果。总相对强度表明，基于y1离子的校正方法在TMT定量中更为准确。

一旦掌握，若操作得当，该方案可在四到五周内完成。在实施该过程时，必须确保所有质量控制步骤均完整执行，以保证最终数据集的准确性达到最高水平。将该方法调整用于研究翻译后修饰，可回答其他科学问题，例如泛素化、磷酸化或乙酰化在疾病进展或药物处理过程中如何发生变化。

该技术问世后，为产品领域研究人员探索细胞和组织中的蛋白质变化开辟了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何从哺乳动物细胞或组织中鉴定并精确量化超过 10,000 种蛋白质。请注意，操作高压 UPLC 和少数硅胶柱时可能存在极高风险，因此在执行该实验流程时，务必采取佩戴护目镜等安全防护措施。

当我们开始着手解决等压标记中已知的比例压缩问题时，首次提出了该方法的想法。我们意识到，大规模分级是一种不仅能够有效缓解这一问题，而且还能增加蛋白质和肽段鉴定数量的极佳策略，从而进一步提升和优化蛋白质组分析。