利用定量点印迹分析法（QDB）高通量绝对测定组织水平特定蛋白质含量

该方法可称为组织水平ELISA，以区别于目前在科研实验室和临床诊断领域普遍采用的细胞和组织水平蛋白质含量相对半定量分析方法。该技术的主要优势可用三个词来概括：高通量、定量和绝对定量。如果再增加一个词，那就是简单。

该技术的影响延伸至蛋白质组学领域，因为生物标志物的验证可以高通量形式实现。该方法在科研和临床领域具有广泛的应用前景。目前，在细胞和组织水平上对蛋白质含量的定量仍处于初级阶段。

一般来说，初次接触该方法的研究人员在学习该技术时不会遇到困难，该技术非常基础，仅需最基本的实验操作技能即可完成。我们很期待通过动物模型来展示该技术的可靠性、简便性和准确性。样本可采用任何传统的样本制备方法进行处理，裂解缓冲液可选用实验室常用的任何类型，无论是否含有去垢剂（如 MP40 或 Triton X）。在本实验中，我们使用的是 Triton X 裂解缓冲液。

取5至100毫克的组织样品，置于1.5毫升离心管中。随后加入200微升裂解缓冲液，缓冲液中需添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。接着将组织置于冰上，使用匀浆器匀浆1分钟。

然后在4°C条件下以8,000 × g离心样品10分钟。收集上清液至新的离心管中，取1 µL用于通过蛋白质定量试剂盒（如BCA法）测定蛋白裂解液中的总蛋白含量。在37°C孵育30分钟，然后使用酶标仪在562 nm处测定吸光度。

在此步骤中，使用已知浓度的重组蛋白作为标准品，将蛋白稀释至每微升12,000皮克的浓度，作为储备溶液。同时，将制备的样品裂解液稀释至每微升4微克。为了获得更可靠的结果，建议使用样品裂解液的混合物，以避免个体样品之间的差异。

对标准蛋白和制备的样品进行系列稀释，以进行典型的剂量研究。添加牛血清白蛋白（BSA）以确保每个样品上样时蛋白质的量大致相等。随后，将10微升系列稀释后的标准蛋白或样品裂解液与10微升2倍上样缓冲液混合。

然后在85摄氏度下加热混合物五分钟。在此步骤中，将一个空的移液枪头盒置于QDB板下方，以避免板的底部接触台面。将最多两微升的样品加载到QDB板各个单元底部的膜中心位置。

加载过程中切勿让QDB板的底部接触任何表面，且每个孔的加样量不宜过多。根据我们的经验，每孔加样量不超过4 µL。接下来，将加样后的QDB板在室温下静置1小时，或在通风良好的环境中于37°C下静置15分钟。

为封闭平板，将QDB平板浸入转移缓冲液中，轻轻振荡10秒。随后，用TBST轻柔冲洗QDB平板三次，然后在持续振荡条件下用TBST洗涤5分钟。接着，在持续振荡条件下，用封闭缓冲液封闭QDB平板1小时。

现在，将一抗用封闭缓冲液按选定浓度稀释，并向普通96孔板的每个单独孔中加入100 µL。将QDB板插入96孔板中，在室温下震荡孵育两小时，或在4°C下震荡孵育过夜。随后，用TBST轻轻冲洗平板三次，再在持续震荡条件下每次用TBST洗涤五分钟，共洗涤三次。

接下来，将二抗用封闭缓冲液稀释至选定浓度，并将100微升分装至96孔板的每个孔中。然后将QDB板放入已加样的96孔板内，在室温下持续振荡孵育1小时。用TBST轻轻冲洗QDB板3次，随后在持续振荡条件下用TBST洗涤3次，每次5分钟。

为了定量，准备ECL底物并将其分装到96孔板中，每孔100微升。然后将QDB板插入96孔板中，在持续振荡条件下孵育两分钟。之后，将QDB板从96孔板中取出，并轻轻振摇以去除多余的液体。

随后，将该板放置于白色微孔板上。接着，打开酶标仪，在用户界面中选择带盖板选项，然后将合并后的板放入酶标仪中进行定量检测。请务必选择带盖板选项，以避免错误。

该图显示了使用从小鼠脾脏、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和前列腺组织制备的裂解液进行 Western 印迹分析，检测兔抗 CAPG 抗体的特异性。通过前列腺、肾脏、脾脏组织裂解液以及纯化的重组 CAPG 蛋白标准品，确定了兔抗 CAPG 抗体在 QDB 分析中的线性范围。实验结果为三次重复的平均值。

此处展示的是从小鼠肾脏、脾脏和前列腺制备的裂解液中对 CAPG 水平进行的绝对定量检测。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 4 至 24 小时内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记在整个实验过程中使用预先确定的特异性抗体。

完成此操作后，还可进行生物统计学分析等其他方法，以回答仅通过细胞或组织水平上单个蛋白质含量的绝对测量才能实现的额外科学问题。自该技术问世以来，已为蛋白质组学领域的研究人员探索蛋白质生物标志物与各种疾病在人群水平上的潜在关联铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何以高通量形式开展QDB分析。

请注意，处理人类或动物组织可能具有极高危险性，因此在进行本操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套。