利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯

我们的实验方案能够绘制细胞与组织间的小分子化学通讯图谱，并已特别应用于探索卵巢癌转移过程中的小分子作用。本技术的主要优势在于能够在维持细胞和组织二维空间完整性的前提下，以无标记的方式检测小分子。该技术使我们能够以非靶向的方式深入探究小分子在卵巢癌转移中的贡献。

这可能会揭示出此前被忽视的新的治疗靶点和通路。该方法可轻松拓展至其他可在琼脂糖中培养的癌症，以及任何空间结构可能对最终细胞表型具有重要意义的其他疾病。确保所有细胞和组分均准备就绪，并在干燥过程中保持耐心，对该实验方案至关重要。

仓促的干燥步骤常常会导致质谱数据质量不佳。由于本方法的样品制备和干燥步骤与通常使用组织或琼脂上微生物的成像质谱实验有显著差异，因此对该方法进行可视化演示有助于理解。首先，在加热板上将琼脂糖加热至 70 摄氏度使其液化。

将八孔隔片置于经 ITO 处理的载玻片上方。通过标准的胰蛋白酶处理，收集 MOE 细胞至 15 毫升锥形管中，离心后加入 1 倍体积的 DMEM 培养基重悬，使细胞浓度达到每 150 微升含 50,000 个细胞，即所需最终密度的两倍。对于未分隔的共培养体系，使用镊子将卵巢组织块添加至四个孔的中央。

铺板前，将200微升细胞悬液与200微升液化琼脂糖分别加入各2毫升离心管中。移液时避免产生气泡。立即向每孔中加入300微升细胞-琼脂糖混合液，并对分隔器持续施加轻柔的向下压力，以确保孔间无泄漏或交叉混合。

确保无气泡产生，且卵巢保持在孔的中央。若移液过程中琼脂糖影响了卵巢的位置，需在琼脂糖冷却前，轻轻使用移液枪头将其调整至中央。随后，将玻片置于37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。

对于分隔共培养，需从薄而光滑的塑料上切割分隔条，可使用无菌一次性培养基盆的侧壁材料。将其切割至恰好能紧密贴合孔板斜边的宽度。

将八孔分隔器置于经 ITO 处理的载玻片上，并将塑料分隔条斜向插入各孔中。按照之前的方法制备细胞培养物，取 100 微升细胞悬液与 100 微升液化琼脂糖于 2 毫升离心管中混合。立即在分隔器的一侧加入 150 微升细胞-琼脂糖混合液，同时对分隔器保持向下的压力。

让琼脂糖冷却并凝固约一分钟，然后移除分隔器。用镊子将卵巢外植体放置在孔板空半侧的中央。在卵巢上方加入150微升细胞-琼脂糖混合物。

将载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。四天后，从琼脂糖凝胶块中移除腔室分隔器。用扁平刮铲将琼脂糖凝胶边缘从腔室上分离，并轻轻向上提起腔室。

若有任何琼脂糖凝胶块发生移动，请轻轻调整其位置，确保彼此不接触。将载玻片置于37摄氏度的烘箱中约四小时，并每小时旋转90度，以确保样品受热均匀。载玻片必须完全干燥。

否则，样品可能在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的高真空环境中发生爆炸。干燥载玻片并监测干燥进程是获得高空间分辨率和高质量质谱数据的最关键步骤。如果出现样品剥落或严重皱缩现象，我们不建议采集质谱数据。

根据基质喷涂仪设定的参数，将基质溶液喷涂至载玻片上。若使用磷红（Phosphorus Red）作为校准物，取一微升磷红加至载玻片上的空白区域。若使用肽混合物作为校准物，则将其与基质在Parafilm上按1:1比例混合以促进离子化，并取0.5至1微升点样于载玻片上。

在成像质谱数据采集前，等待校准物完全干燥。使用永久性记号笔在载玻片的每个角落画一个“X”，然后使用相机或扫描仪以1200 dpi的分辨率获取光学图像。在本实验中，必须仔细监测烘箱中的载玻片，以确保获得最佳干燥的ITO载玻片，从而得到表面平整、干燥且几乎无皱褶的琼脂糖样品。

该图显示了应避免出现的褶皱。褶皱可能会轻微影响高度，从而影响成像质谱信号的质量准确性。轻微的褶皱不会影响数据质量。

理想位置的组织应尽可能靠近中心。若组织未被分割，应将其置于孔的中央；若组织已被分割，则应将其置于半三角形的中央，以避免成像质谱（IMS）数据受到边缘效应的干扰。组织位置不佳时进行成像，可能因边缘效应而产生虚假的质谱信号。

利用干燥的切片图像来指导基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）选择成像区域。在卵巢组织周围选取了若干小区域进行成像质谱分析（IMS），空间分辨率为50微米。展示了未分隔共培养体系以及分隔培养室装置中m/z信号的代表性图像。

最重要的是要记住，所得数据的质量完全取决于样品制备的优劣。请特别注意干燥过程。最令人兴奋的部分是通过其他实验（如侵袭实验或定植实验）验证以此方式发现的小分子，从而确定其有效浓度，并将其结果转化为人类生物学意义。

我们预期，通过更深入地理解卵巢癌原发性转移过程中的机制，将有助于发现卵巢癌潜在治疗靶点的新通路。