荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

我们的研究致力于开发高通量、图像引导的单细胞基质辅助激光解吸电离质谱工作流程，以揭示细胞异质性，并将分子谱型与复杂系统中细胞的身份、功能及响应相联系。

先进的仪器，例如 MALDI-2 和高空间分辨率质谱仪，能够实现对单个细胞的靶向、空间分辨分析，从而提高灵敏度，并扩展复杂组织中分子谱分析的应用范围。当前面临的挑战包括灵敏度有限、样品间重复性差以及数据分析复杂。MALDI 数据通常稀疏，且包含数千个细胞和数百种分子的大型数据集需要强大的计算工具。

本方案填补了高通量分析单个细胞甚至细胞器的方法学空白，能够对异质性进行极为细致的研究，并深入揭示分子与细胞生物学及其功能的机制。

该方案可实现对分散在载玻片上的细胞进行快速靶向分析，无需细胞操作或全区域扫描，显著提高了通量。

[旁白] 首先，用2至3毫升150毫摩尔的醋酸铵溶液冲洗每张载玻片，以去除可能干扰显微镜观察和MALDI基质涂布的甘油和盐晶体，然后在温和的氮气流下干燥载玻片，或让其完全自然晾干。将干燥后的载玻片装入显微镜载物台。使用至少10个均匀分布在整张载玻片上的支撑点进行显微镜聚焦。使用适合DAPI和明场成像的滤光片，在5倍至10倍放大倍数下获取整张载玻片的拼接荧光图像，确保图像中清晰捕获到载玻片上的定位标记。使用显微镜软件（例如ZEN ZEISS）对拼接图像进行拼合。验证垂直相邻的图像瓦片之间无偏移。使用显微镜软件将每张拼合后的图像处理并导出为BigTIFF文件；若最终图像大小小于2吉字节，也可导出为标准TIFF格式。将20毫克2,5-二羟基苯乙酮溶解于1.5毫升丙酮中。将载玻片放入升华室的支架中，然后将支架置入升华装置内。用移液器将溶解的基质溶液滴加到陶瓷晶片上，待丙酮完全蒸发后，关闭升华室并密封。在冷却室中加入冰水混合物，并将其牢固地放置在升华室顶部。开启真空泵，使系统平衡5分钟。通过将室温加热至200摄氏度并维持5分钟，开始升华过程。5分钟后，从装置上移除冰水浴。将温度调至25摄氏度，并在室顶部放置散热片。缓慢释放升华室内的压力。打开升华室，小心取出载玻片。打开MicroMS软件，使用“图像组”选项对BigTIFF显微图像进行降采样，以同时兼容明场和荧光通道。进入“Blob Options”工具，调整最大和最小斑点尺寸，以定义可接受的斑点尺寸范围。设置荧光通道的阈值以用于斑点检测。设定圆形度值，以定义被识别细胞所需具备的圆形程度，并选择颜色。使用“Blob Find”选项检测斑点。当系统提示时，将斑点列表以所需名称保存。使用“Distance Filter”工具设置每个细胞之间的最小距离。通过测试点检验误差，以准确确定偏移误差。使用MTP Slide Adapter II将载玻片装入仪器。返回运行MicroMS的计算机后，通过远程桌面应用程序访问质谱仪计算机。若为首次使用该仪器，需通过依次点击“Tools”和“Instrument Settings”来验证其位置。在弹出窗口中查看包含X和Y坐标的坐标集，并在MTP Slide Adapter II的几何结构上选择这些特定点。在MicroMS窗口中更新X和Y坐标。利用质谱仪的摄像头和载物台控制功能，导航至载玻片上一个易于识别的位置，并复制仪器坐标。在MicroMS中，在显微图像中找到相同位置，右键单击，并将坐标输入弹出窗口中。将坐标四舍五入至最接近的整数，并以空格分隔。当添加了三个配准点后，其中一个圆圈将变为红色，表示其相对于配准位置偏差最大。使用Control + 右键单击删除该配准点，然后重新尝试。在“File”菜单下，选择“Save”，然后选择“Registration”以保存配准文件。在载玻片上显示斑点后，进入“File”、“Save”，然后选择“instrument positions”以保存仪器位置文件，再通过远程桌面软件将此文件传输至仪器计算机。打开自定义XEO文件，并将其内容复制到仪器计算机上的MTP Slide Adapter II .XEO文件中。保存该文件，以使用细胞位置信息更新此几何文件。点击“Automation”标签页，选择“New”以创建新的自动运行任务。在显示的样本区域上拖动以选择细胞，右键单击将其添加到分析列表中。保存自动运行任务，然后点击“Start Automatic Run”以开始数据采集。该图展示了单细胞MALDI-2质谱分析如何揭示不同及同一脑区内的脂质基础细胞异质性。均匀流形近似与投影（UMAP）分析按脑区对细胞进行分离，在纹状体、海马和皮层中形成明显的聚类。Leiden聚类揭示了四种基于脂质的细胞亚群。此外，观察到各聚类特异性的脂质特征，不同注释脂质的强度分布具有明显差异。来自六张皮层载玻片的质谱数据也显示出跨载玻片一致的脂质检测结果。此外，来自不同载玻片的皮层细胞表现出重叠的UMAP分布，表明批次效应极小。