使用 eVOLVER 设计自动化、高通量、连续细胞培养实验

eVOLVER 为研究人员提供了实验自由，能够自主定义培养生长实验，通过多个参数的自动反馈进行调控，并可根据需要扩展至任意规模。eVOLVER 比其他设备更具灵活性。用户可轻松使用 Python 自定义软件，也可通过修改用于容纳各培养物传感器的智能套管来自定义硬件。

该系统乍一看可能显得较为复杂，包含多个组件和连接。可视化指南能够帮助初次使用者更有信心地独立开展实验。正确的设置至关重要。

务必了解每个组件的功能，以便确认它们能否正常工作。确保所有线路正确连接且接头紧固。

尽管 eVOLVER 的设计主要用于在不同条件下对细菌和酵母进行好氧培养，但它也可经改造用于厌氧发酵或维持悬浮状态的哺乳动物细胞。本视频将演示如何使用 eVOLVER 平台设置、初始化并运行高通量连续培养实验。实验前一天，根据论文所述准备培养基、小瓶和接种物。

在三个大烧杯中，准备两杯10%次氯酸钠溶液和一杯70%乙醇溶液。使用eVOLVER设备上的开关，先打开eVOLVER的5伏电源，等待5秒后，再打开12伏电源。若从同一瓶培养基中为多个小瓶供液，请使用管路分路器连接多条培养基输入管路。

可使用较少的组件构建定制的管路分流器。将培养基输入管路浸入第一个漂白剂烧杯中，将培养基流出管路浸入第二个漂白剂烧杯中。将培养基输入管路的下游端与第二个烧杯中的流出管路连接。

将废液管放入废液桶中。向废液桶中加入一到两升次氯酸钠溶液，以对实验过程中产生的废液进行灭菌。通过 eVOLVER 上的触摸屏进入设置部分，运行所有泵 20 秒，使 10% 次氯酸钠溶液充满流体管路。

让漂白剂在管路中停留至少30分钟以达到灭菌效果。再次使用触摸屏运行泵，直至管路不再浸没，通过管路推动空气，尽可能排出漂白剂。将培养基输入管路放入盛有乙醇的烧杯中，用乙醇充满管路，再用空气冲洗管路。

然后，使用较低位置的连接器将培养基输入管路连接到培养基瓶，并运行泵，直到培养基完全流经管路，以冲洗掉残留的乙醇。将已灭菌的样品管部分插入 eVOLVER 智能套管中，并根据颜色编码，将输入管路连接到较短的进液吸管，将废液管路连接到较长的出液吸管。在 eVOLVER 触摸屏上进行设置，以10秒为间隔依次运行所有泵，使培养基充满样品管。

通过目视检查，确保外流泵正通过外流吸管有效排出培养基，以防止溢出。然后，将小瓶向下推，直至完全被智能套筒包裹。在 eVOLVER 触摸屏交互设置页面上，用手指滑动触摸屏或按下“全选”按钮以选中所有小瓶，并将初始条件设置为温度 30 摄氏度、搅拌速度 10。

在计算机上指定将要运行实验的 eVOLVER 设备。确保已选择所需的校准设置。打开 eVOLVER 控制面板并导航至实验管理页面。

在实验导航面板中选择基础实验或一个已有实验作为起点，然后点击克隆。进入实验编辑页面。使用试管选择器和参数定义面板，根据实验设计将温度调整为30摄氏度，并为每个试管设置光密度（OD）的上限和下限阈值。

单击“保存”以保存实验。然后单击箭头返回实验管理器页面，再单击“播放”按钮以运行实验。实验开始后，请转至交互式仪表板中的实时数据面板。

对于每个试管，检查 OD 值是否保持在零。浏览温度曲线图，确认温度已达到或正趋近于 30 摄氏度。为制备接种物，首先测定过夜培养物的 OD 值，并根据试管体积为 25 毫升、目标起始 OD 值约为 0.05 的条件，计算过夜培养物所需的目标完全稀释倍数。

通过取样口，用移液器加入计算好的接种物体积或多种接种物的混合液。查看仪表盘上的图表，确认光密度（OD）正在上升至0.05。在实验进行过程中，可实时监测细胞生长情况和小瓶内的培养条件，以便研究人员在出现问题时及时干预。

eVOLVER 是一种可自动控制培养条件多参数的连续培养平台。当根据 eVOLVER 生长速率数据将对数比值与世代数进行绘图时，野生型、温度敏感型和盐敏感型组别之间显示出定性差异。颜色表示筛选温度，而虚线用于区分盐浓度。

利用每个图中线性部分至少三个数据点进行斜率拟合，可得到描述变异菌株相对于参考菌株竞争能力的定量适应度值。负的适应度值表明变异菌株被参考菌株所淘汰。务必检查所有泵是否高效运行，并确保流体管路无任何堵塞。

溢流可能破坏实验，并可能损坏智能套管。可对从 eVOLVER 中采集的样品进行后续测序，以检测实验引起的基因组改变。该信息可用于设计新的菌株或系统。

对于使用实验室进化或文库筛选的研究人员而言，在每次 eVOLVER 实验中施加独特的筛选压力非常简便。反馈控制和动态环境现在也易于实现。实验结束后，废液瓶中将含有少量次氯酸钠和乙醇。

请咨询实验室安全负责人，以妥善处理废弃物。