使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化

该方法有助于解决传统微生物培养方法中存在的问题，提供了一个低成本、操作简便且结果可靠的实验平台，可用于自动化的微生物培养与适应性进化研究。该技术可实现操作自动化，进一步减少人力消耗。

同时，该技术具有良好的培养性能，结果可靠且操作简便。该技术主要应用于微生物学研究领域，如生长曲线测定、适应性实验室进化以及单因素多水平分析。开始实验准备时，将内径为0.41毫米、外径为0.71毫米的注射针头连接至快速接头A和试剂瓶。

然后在121摄氏度下对所有设备进行高压灭菌15分钟。安装微流控芯片时，打开操作室的门并抬起光纤探头。将电场孔与针头对齐后，轻轻地将芯片放置在芯片基座上，然后将两个定位柱插入定位孔中，并放下光纤探头。

接下来，根据论文中所述的位置编号，将芯片上的快速连接器A连接到微生物微滴培养系统（MMC）的相应端口。操作完成后，关闭操作室的门。用培养基将培养的埃希氏菌（Escherichia coli）MG1655菌悬液稀释至OD600为0.05至0.1，以获得10毫升的初始菌液。

初始化MMC时，请点击“初始化”选项卡。当初始化界面出现后，将培养温度设置为37摄氏度，光电信号值设置为0.6。初始化过程大约需要20分钟。

随后，将一个已灭菌的试剂瓶放置于洁净工作台上并拧紧瓶盖。使用10毫升无菌注射器，将3至5毫升的MMC油从注射器针头注入试剂瓶的侧管中。然后缓慢倾斜并旋转试剂瓶，使油充分浸润瓶内壁。

向瓶中注入5毫升初始细菌溶液后，再注入5至7毫升MMC油以填满试剂瓶。拔出试剂瓶上的独立快接接头A，并将快接接头A插入瓶上的快接接头B，完成样品注入操作。操作完成后，打开操作室的门，将试剂瓶放入金属浴中。

拔出芯片的 C2 连接器和试剂瓶的快接接头 A。将试剂瓶侧管连接器连接至 C2 连接器，顶部管路连接器连接至 O2 连接器。然后关闭操作舱门。

选择生长曲线测量功能，在参数设置界面点击“生长曲线”，输入数值 15。然后打开 OD 检测开关，并将波长设置为 600 纳米。点击“开始”选项卡以启动液滴生成。

该过程需要15分钟才能完成。当主界面上弹出提示消息的窗口时，打开操作室的门，取出试剂瓶，并连接C2和O2接头。关闭门后，单击弹出窗口中的“确定”按钮，系统将自动培养液滴并检测OD值。

当生长曲线进入稳定期时，单击“数据导出”按钮以导出OD数据。选择数据保存路径，并以CVS格式导出培养期间记录的OD值。为绘制生长曲线，可使用Excel或Origin 9.0等绘图软件。按照前述方法，将初始菌液、新鲜培养基和MMC油分别注入已灭菌的试剂瓶中，用于制备新鲜培养基中的初始菌液。

要选择适应性进化功能，请在软件中点击 ALE。在参数设置界面中，打开 OD 检测开关，然后设置文中所述的所有参数，并点击“开始”标签以启动液滴生成。该过程大约需要 25 分钟。

在每次传代培养期间，观察液滴的最大OD值是否显著增加。若OD值增加且满足实验要求，点击数据导出按钮以导出OD数据。如需从MMC中提取目标液滴，请点击筛选标签，选择液滴提取功能。

然后选择“收集”选项，并点击目标液滴的编号。完成后，点击“确定”。等待弹出窗口提示消息。随后，将CF快速连接头插入微型离心管中进行收集，然后点击“确定”。一到两分钟后，当软件界面弹出新窗口并提示消息时，将CF快速连接头重新插入，然后点击“确定”，使MMC继续运行。

当下一个目标液滴到达液滴识别位点时，按前述方法收集。使用2.5 µL移液器取出液滴，并将其转移至90 mm固体培养板上，随后用边长为3 cm的玻璃涂布棒均匀涂布，然后将平板置于37 °C恒温培养箱中培养72小时。之后，挑取3至5个独立的细菌菌落，分别接种于含有10 mL新鲜培养基的50 mL摇瓶中，在37 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中振荡培养48至72小时。

孵育结束后，按照相关标准规程将培养的菌液保存于甘油管中。代表性分析显示了整个适应性进化过程中50个液滴的生长曲线。观察发现，依赖甲醇的必需大肠杆菌菌株（MeSV2.2）表现出初始生长缓慢，随后进入快速生长阶段。

单独绘制了第六个液滴在整个适应性进化过程中的生长曲线。第一代的最大OD600值为0.37，在最后一次传代培养周期中增加至0.58，表明第六个液滴中的菌株已实现了明显的适应性进化。此外，比较了第六个液滴菌株与初始菌株的生长曲线。

与初始菌株相比，液滴六号菌株在稳定期表现出更高的最大比生长速率和细胞浓度。最重要的是确保仪器芯片与试剂瓶的连接正确，这是液滴操作能够正常进行的前提。该方法为微生物培养提供了新的思路，同时也为菌株的适应性进化提供了高效且低成本的平台。