利用基于环状RT-PCR的策略对玉米线粒体中初级转录本和加工转录本的区分与定位

本方案用于玉米线粒体中初级转录本和加工后转录本的定位与区分。该技术包含RNA标准化步骤，可最大限度减少不稳定的5'三磷酸基团对初级转录本与加工后转录本之间清晰区分所造成的干扰。除玉米线粒体外，该方法还可应用于质体及其他植物线粒体。

首先将20克发育中的籽粒收集到预冷的50毫升离心管中，置于冰上。将籽粒转移至预冷的研钵中，加入10至20毫升冰冻提取缓冲液。充分研磨籽粒，再加入更多提取缓冲液，然后将研磨后的组织通过两层滤布过滤。

将滤液在8,000 × g条件下离心10分钟。然后将上清液转移至新管中，并弃去滤液。再将该管在20,000 × g条件下离心10分钟。

弃去上清液，并用六毫升洗涤缓冲液重悬沉淀。将悬液分装至五个1.5毫升无RNase的离心管中，在14,000 ×g 条件下离心五分钟。弃去上清液，将线粒体沉淀置于液氮中速冻保存。

根据制造商说明书，使用商业试剂提取线粒体RNA，并进行RNA 5'多磷酸酶处理。然后，使用RNA纯化试剂盒回收RNA。用于RNA提取的试剂具有危险性。

始终在通风橱中操作，并穿戴实验服和手套。使用相同量的经5'多磷酸酶处理与未处理的线粒体RNA，准备两个环化反应。将两个反应体系均在16摄氏度孵育12至16小时，然后使用先前所用的RNA纯化试剂盒回收自连接的RNA。

首先，将26 SCRT与最多七种其他反转录引物按等比例混合，制备引物混合液。根据论文中的说明，构建两个反转录反应体系，并在42摄氏度下孵育50分钟。为了对cDNA进行标准化，取经过5'多磷酸酶处理或未处理的RNA所获得的等体积cDNA，分别制备两组PCR反应，并按照论文中描述的热循环条件进行扩增。

通过26S成熟rRNA进行标准化是区分初级转录本与加工后转录本的关键步骤。比较两种PCR产物的丰度，如有必要，可通过调整模板cDNA的用量来优化标准化。使用适量标准化后的cDNA，配对相应的反向引物（如靶标转录本5'端至3'端连接区域的引物），按照文稿中的说明进行PCR反应。

然后，使用凝胶DNA回收试剂盒分离通过巢式PCR扩增出的明显条带。采用标准技术将经凝胶纯化的PCR产物克隆至载体中，并通过菌落PCR筛选含有目标插入片段的阳性克隆。对PCR产物进行测序，并利用基本局部比对搜索工具（BLAST）将测序数据与玉米线粒体基因组进行比对。

选择玉米作为研究生物，搜索核苷酸序列数据库。找到环化转录本的5'端至3'端连接区域，并确定转录本5'端和3'端的精确位置。扩增用于制备RNA探针的DNA片段，并将其克隆至先前使用的载体中，该载体在插入位点上游17个碱基对处含有T7启动子。

使用商品化试剂盒，用 dig-11-UTP 标记 RNA 探针，并进行 RNA 杂交。通过比较经标准化的5'多磷酸酶处理与未处理的 RNA 所获得的环状 RT-PCR 产物，区分初级转录本和加工后的5'端。随后，根据定位结果设计定量 RT-PCR 引物，并通过 RT-PCR 验证区分结果。

以COX-2基因为例，展示如何利用基于环状RT-PCR的策略对玉米线粒体转录本进行定位和区分。将标准化的cDNA用作PCR模板，从5'多磷酸酶处理的样品中扩增出两条明显的条带。这两条条带被命名为COX-2一和COX-2二，经凝胶回收后克隆至载体中。

菌落PCR结果显示，阳性克隆中含有大小不同的插入片段，表明其末端具有异质性的5'端或3'端。测序结果表明，COX-2-1和COX-2-2的3'端相同，均位于终止密码子下游39个核苷酸处，而它们的5'端则分别位于起始密码子上游992至1,030和1,276至1,283个核苷酸处。通过RNA凝胶印迹杂交实验验证了环状RT-PCR的定位结果，检测到两条主要条带，其大小与COX-2-1和COX-2-2相似。

另设计了一对反向引物，用于扩增在RNA凝胶印迹中检测到但在首次环状RT-PCR中未检测到的COX-2三条和四条带。定量RT-PCR结果证实，COX-2一条、二条、三条和四条带均对5′多磷酸酶敏感，表明它们具有初级5′末端。尽管本方案中未包含，但仍可通过引物延伸分析来验证5′端定位结果。