E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

自组装蛋白质纳米颗粒（SAPNs）可用于开发针对多种传染病的疫苗。本文所述方法可用于纯化、复性及表征含有六螺旋束结构的SAPNs。该纳米颗粒能够以类似天然的构象呈递三聚体抗原。

经过轻微修改，该方法可应用于其他创新的SAPN疫苗构建体。此外，该方法可轻松转移至临床试验的规模化生产。对于表达六螺旋束SAPN的收获大肠杆菌（E.coli）的裂解，使用输出功率为150瓦的探头，在冰上对重悬的菌体沉淀进行超声处理，超声条件为：每次超声4秒，间隔6秒，总时长5分钟，缓冲液体积为40毫升，且不含咪唑。

离心细胞裂解液以获得澄清的上清液，并将上清液转移至无菌的150毫升锥形瓶中。然后用新鲜的不含咪唑的缓冲液将样品定容至最终体积100毫升。为分离目标蛋白，打开FPLC软件并点击“新建方法”选项。

在方法设置菜单中，打开柱位置下拉菜单并选择 C1 端口 3。在按技术显示的下拉菜单中，选择亲和。在柱类型下拉菜单中，选择其他、HisTrap HP 和 5 毫升。

“柱体积”和“压力”框将自动设置为相应的数值。单击“方法概要”，然后从箭头旁边的“阶段库”弹出菜单中，将“平衡”和“上样”按钮、三个“柱洗涤”按钮以及“洗脱”按钮拖至方法流程中，随后关闭“阶段库”菜单。单击“平衡”并根据表格中列出的数值进行设置：初始缓冲液B为4%，最终缓冲液B为4%，柱体积为5。

点击“示例应用”。在“样品加载”框中，选中“使用样品泵在色谱柱上进样”的单选按钮，并确认“使用系统泵进行样品注入”框中“使用方法设置中的流速”旁边的复选框已被勾选。将“体积”框中的数值更改为 100 毫升，并将“馏分收集方案”设置为启用。

取消勾选“使用方法设置中的组分大小”选项，将组分大小更改为4毫升。单击第一个“柱洗涤”按钮，将表中所列数值设置为：初始缓冲液B，4%；终末缓冲液B，4%；柱体积，10。勾选“组分收集方案启用”复选框，然后取消勾选“使用方法设置中的组分大小”。

将组分体积更改为四毫升，然后点击第二个柱洗涤按钮。在表格中设置以下数值：初始缓冲液B为0%，最终缓冲液B为0%，柱体积为5。勾选“启用组分收集方案”复选框，并取消勾选“使用方法设置中的组分体积”。

将组分体积更改为四毫升，然后点击第三个柱洗涤按钮。在表格中设置以下数值：初始缓冲液B为0%，最终缓冲液B为0%，柱体积为10。点击“组分收集方案启用”按钮，并取消勾选“使用方法设置中的组分体积”复选框。

然后，将组分体积更改为四毫升。单击洗脱按钮，并右键单击表格中的信息。在弹出菜单中，单击删除步骤，然后将等度梯度按钮两次拖动到表格中，以生成两条记录。

将第一个条目的值设置为初始缓冲液B，30%，终末缓冲液B，30%，柱体积，10。将第二个条目的值设置为初始缓冲液B，100%，终末缓冲液B，100%，柱体积，10。单击“启用组分收集方案”按钮，并勾选“使用方法设置中的组分体积”选项框。

然后，点击“另存为”并将其命名为纯化。将FPLC的泵A管路放入不含咪唑的洗涤缓冲液中，将泵B管路放入500毫摩尔咪唑缓冲液中。将样品泵管路放入100毫升样品中，运行纯化程序。

当需要使用60%异丙醇洗涤时，暂停程序，将泵A的管路从不含咪唑的洗涤缓冲液转移至60%异丙醇洗涤液中，然后重新启动程序。洗涤步骤结束后，再次暂停程序，将泵A的管路移回不含咪唑的洗涤缓冲液中，并重新启动纯化程序。为评估纯化后蛋白的纯度，首先将流穿液、洗涤一、洗涤二和洗涤三步骤收集的组分分别合并至单独的50毫升锥形管中。

接下来，将每个样品管中的15微升与15微升2X Laemmli缓冲液分别加入到0.5毫升的微量离心管中，并在95摄氏度下变性10分钟。孵育结束后，使用三块预浇制的4至20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，在Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳缓冲液中组装凝胶电泳装置。在每块凝胶的第一孔中加入8微升分子量标记物，其余各孔加入30微升变性样品。

以200伏电压电泳，直至染料前沿到达凝胶底部，然后用去离子水短暂冲洗凝胶，并立即使用无染料成像系统进行成像。随后，确定含有正确大小蛋白条带的组分，并合并这些组分。对于六螺旋束SAPN的复性，将10至20毫升合并后的蛋白样品加入截留分子量为10千道尔顿的透析盒中。

将样品盒在8摩尔尿素、20毫摩尔Tris、5%甘油和5毫摩尔TCEP中于室温透析过夜。次日早晨，每两小时逐步降低透析缓冲液中的尿素浓度，每次减少2摩尔，以缓慢去除样品中的尿素。当尿素浓度降至2摩尔时，将透析装置转移至4摄氏度，继续在120毫摩尔尿素、20毫摩尔Tris和5%甘油中透析过夜，完成复性过程。

第二天早晨，从盒中取出复性后的蛋白质，将六螺旋束SAPN通过0.22微米的聚偏二氟乙烯注射器滤膜过滤。为测定六螺旋束SAPN的平均粒径，取45微升六螺旋束SAPN加入一次性比色皿中，并将比色皿放入动态光散射（DLS）仪器中。接着，新建一个测量文件，运行预先编写的标准操作程序，用于在25摄氏度条件下测定溶于含120毫摩尔尿素、20毫摩尔Tris和5%甘油缓冲液中的蛋白质。

然后，开始测量。每次运行将计算出Z平均粒径、PDI和分布结果。仪器将对样品进行五次读数。

这种完全组装的六螺旋束SAPN基于可折叠成包含60个单体拷贝颗粒的蛋白质序列构建而成。使用总细胞裂解液，通过镍柱FPLC纯化六螺旋束SAPN单体，结果显示蛋白在150和500毫摩尔咪唑条件下均被洗脱。色谱图还显示另外两个峰，分别对应总体积为185和210毫升的异丙醇洗涤和无咪唑洗涤组分。

通过梯度SDS-PAGE凝胶可鉴定重组蛋白的组分及纯度，目标蛋白主要位于第68至79组分中。使用抗His和抗167D4抗体进行的Western印迹分析表明，合并的组分确实为目标蛋白。印迹结果还显示存在六螺旋束SAPN多聚体。

含有目标蛋白单体的样品通过透析折叠形成完全组装的六螺旋束SAPN，采用动态光散射（DLS）和纳米颗粒追踪分析法测定其粒径分布。透射电子显微镜观察显示，六螺旋束SAPN颗粒形态完整，其尺寸分布结果与上述两种粒径分析技术所得数据一致。本实验方案中最重要的步骤是六螺旋束SAPN的复性折叠。

复性缓冲液的正确pH值和离子强度至关重要。在纯化过程中使用异丙醇洗涤，可将污染的LPS降低至极低水平。然而，如有必要，可进一步使用阴离子交换柱以更彻底地去除LPS。

该技术可轻松适用于人类应用。一种由细菌表达的自组装蛋白纳米颗粒（SAPN）已实现放大生产，用于即将开展的1/2a期疟疾临床试验。