一种基于荧光的检测方法用于表征和定量人肠道类器官中脂滴的形成

本方案描述了若干用于定量人肠道类器官中脂滴形成的方法。该方法可作为高通量筛选平台，用于检测调控脂滴形成的药物。我们所描述的方法基于一种特异性识别脂滴的染料以及活检来源的肠道类器官。

因此，该方法为脂滴形成提供了稳定、准确且具有生理相关性的模型。本方案可用于筛选针对特定患者、可调节脂滴形成的新型候选药物，例如用于DGAT1缺陷型患者。该脂滴形成检测方法还可应用于其他类型的类器官培养，以研究其他细胞类型中的脂质代谢。

该检测在很大程度上依赖于类器官培养的密度。应尽量确保不同样本和实验之间的类器官密度一致。本检测的可视化演示至关重要，因为必须展示类器官的正确培养方法及其操作方式，以确保脂滴形成的准确分析。

制备类器官后，小心吸除培养基，注意不要扰动基底膜基质的液滴。向第一孔类器官中加入500微升冷的基礎培养基。使用P1000移液器轻轻吹打，使基底膜基质液滴中的类器官充分解离。

根据需要，在下一个孔中使用相同的培养基重复此操作，但每 500 微升基础培养基收集的孔数不得超过两个。将类器官收集至低吸附性的 1.5 毫升微量离心管中，并在小型台式离心机中离心 15 至 20 秒。向沉淀的类器官中加入 400 微升胰蛋白酶。

在37摄氏度水浴中孵育5分钟。随后，使用P200移液器轻轻吹打悬液，上下混匀，以分散残留的细胞团块。再次在37摄氏度水浴中孵育5分钟。

当仅剩单细胞时，加入一毫升基础培养基，将细胞在小型台式离心机中离心15至20秒。彻底吸除上清液。使用P200移液器将单细胞重悬于200微升新鲜hSI-EM中，并额外加入800微升hSI-EM。

然后计数悬浮液中的细胞数量，并计算达到最终细胞密度所需的细胞体积。取出相应体积的悬浮液，将细胞密度调整至每微升750个细胞。按照2:1的比例向细胞悬浮液中加入基底膜基质。

轻轻吹打混匀悬浮液，注意避免产生气泡。在预热的培养板中，若使用24孔板，则每孔接种3个10微升的液滴；若使用96孔板，则每孔接种1个5微升的液滴。将培养板放入37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育10至15分钟，使液滴凝固。

同时，将适量的 hSI-EM+Y 在 37 摄氏度的水浴中预热。随后，小心地将预热的 hSI-EM+Y 加入培养板的每孔中。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养细胞。

培养两到三天后，更换为 hSI-EM 培养基，并确保每周更换两到三次。首先，在室温下称取 0.2 克液态油酸。加入 1.5 毫升细胞培养级无菌 PBS，将混合物加热至 70 摄氏度并持续一小时，期间需间歇性涡旋振荡。

接着，称取 5.89 克无脂肪酸 BSA，溶于 33.9 毫升 PBS 中。将混合物置于 37 摄氏度水浴中加热，直至 BSA 完全溶解。再次涡旋震荡油酸混合物，形成细小液滴的乳剂，然后立即用玻璃移液管将其加入 BSA 溶液中。

将混合物在 37 摄氏度下保持 30 分钟，直至形成澄清的淡黄色溶液。按照先前所述方法传代类器官，并将类器官来源的单细胞接种至黑色透明底 96 孔板中。在 hSI-EM 培养的第 6 天，用含有 1 毫摩尔油酸和 BSA 复合物的 hSI-EM 培养基替换原培养基。

将细胞在37摄氏度条件下孵育16至17小时，可选择是否添加0.1微摩尔的DGAT1抑制剂。随后，在不干扰基底膜基质液滴的情况下吸除培养基。通过向孔中加入100微升4%中性缓冲甲醛，在室温下固定类器官30分钟。

轻柔地去除甲醛，并用每孔150微升PBS小心洗涤细胞。在避光、室温条件下，用含0.25毫克/毫升LD540和DAPI的PBS对细胞进行脂滴染色，孵育15分钟。随后用PBS小心洗涤各孔。

对于类器官整体的概览图像，使用适用于共聚焦荧光成像的40倍物镜。将显微镜设置为DAPI和LD540染料的成像条件，采用此处所示的激发和发射参数。将针孔大小设置为1个艾里单位，以获得足够的z轴分辨率。

为了对球形类器官的一半进行成像，将z轴层厚设置为约85微米。使用适当的图像处理系统，通过点击“Image”、“Stacks”、“Z Project”，将每个类器官的z轴层厚图像转换为最大投影图像。通过点击“Image”、“Adjust”、“Threshold”，调整最大投影图像的阈值，使BSA载体对照样本中无LD540信号可见。

使用这些设置对每张图像进行阈值处理。然后使用“分析”菜单中的“分析颗粒”功能，测量每个最大投影的荧光总面积。为了准确分析脂滴的形成，类器官在经油酸刺激及后续染色前，不应接种过密。

这一点对于共聚焦显微镜和酶标仪检测尤为重要，因为重叠的类器官可能会干扰荧光信号。经1 mM油酸过夜刺激后，可通过倒置明场显微镜观察脂滴的形成。脂滴的积聚会散射透射光，因此刺激后的类器官呈现较暗的外观，而未受刺激的类器官则呈半透明状。

在油酸刺激的类器官固定并染色后，可使用共聚焦显微镜观察脂滴的形成。由于类器官具有三维结构，常规的落射荧光显微镜会因焦外背景信号干扰而不适用，因此需采用共聚焦z轴层扫技术来表征类器官中的脂滴形成。此外，还可使用荧光酶标仪对共聚焦显微样品进行定量分析，并以Hoechst荧光信号进行归一化处理。

酶标仪检测结果显示，与未处理的类器官相比，经DGAT1抑制剂处理的类器官细胞中LD540信号显著降低。可通过流式细胞仪对单个细胞中脂滴形成的量化进行分析。此处所示的设门策略适用于解离后的人肠道类器官。

最终活细胞群体的SSC-A和LD540信号的代表性直方图显示，脂滴形成会导致SSC-A升高，这是由于细胞内脂滴的形成所致。此外，LD540可特异性染色储存在脂滴中的脂质，因此在脂滴形成被诱导后，LD540信号也会增强。因此，脂滴的形成通过SSC-A和LD540的平均荧光强度的升高来测定。

本方案中最关键的步骤是人肠道类器官的培养以及油酸与BSA的正确配比。为了适应更多实验条件，该检测可使用荧光酶标仪进行分析。为校正每孔中的类器官数量，将LD540信号相对于DAPI信号进行了归一化处理。

利用该技术，研究人员可以在类器官系统中研究脂滴的形成，并改进多种分析技术（如电子显微镜）以验证其研究结果。