无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

我们的目标是在监测类器官发育过程中及其对药物反应时的生物物理变化时，建立一种实时、无标记的成像方法。本方案通过人工智能驱动的突变分析和定量纹理筛选，支持对活体类器官进行高效成像和非侵入性药物测试，从而推动生物医学研究。我们计划进一步整合无标记三维成像与年度分析，以实现高分辨率、非侵入性的类器官研究，服务于疾病建模和精准医学。

首先，从含有细胞外基质的48孔板的每个孔中吸除废弃培养基。向每个孔中加入200 µL细胞回收溶液，在4°C下孵育30分钟。使用移液器轻轻收集类器官悬液，并转移至微量离心管中。

将离心管在150g下离心3分钟，然后小心移去上清液。为机械解离沉淀物，加入200 µL培养基重悬，使用P200移液器上下吹打20至30次，随后离心3分钟。离心并去除上清液后，向沉淀物中加入培养基与新鲜细胞外基质（ECM），体积比为1:4，轻轻吹打混匀。

将混合物每滴15微升加入48孔板的每个孔中。将培养板倒置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时，以使细胞外基质（ECM）聚合。聚合完成后，向每孔加入200微升新鲜培养基，并用PBS填充外周的空孔。

为准备成像样品，将15微升类器官ECM滴加到1.5号盖玻片底部的成像培养皿中，在室温下孵育1分钟。将培养皿倒置放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。然后，轻轻加入足够的培养基，完全浸没类器官。

传代后第五天，在成像前立即用 PBS 清洗样本两到三次。接着，开启环境控制器以进行成像。腔室控制器将自动将温度设置为 37 摄氏度，二氧化碳浓度设置为 5%。按下 Door 按钮以打开门。

加入水以在腔室孔内形成一层薄水层。将成像培养皿放入容器支架中，插入成像腔室，并用针固定以防止移动。关闭门以避免外界光线干扰。

现在，启动 TomoStudio X 软件并登录。单击“开始”以打开主窗口，然后单击左上角的“添加项目”并指定实验。确认已选择正确的培养基类型，以确保使用适当的折射率。

在面板中点击目标孔，然后点击顶部的“创建”以将该孔登记为样本。接着，点击右上角的“ROI 设置”以定义培养皿中的感兴趣区域。设置完成后，点击右下角的“运行实验”以打开图像采集窗口。

单击角落处的“Load Vessel”以显示明场图像。使用 Z 和 Z 按钮调整 Z 位置，使图像聚焦清晰。在“Single Imaging”选项卡中，调整 ROI 尺寸。

在160微米×160微米的视野范围内捕获类器官，并采集深度达140微米的图像序列。进入“时间推移成像”选项卡以设置长期成像，设定所需的持续时间和时间间隔。点击“扫描”图标以捕获当前感兴趣区域（ROI）的位置。

单击明场（BF）按钮以调节明场成像的强度和曝光值。在预览面板中移动感兴趣区域（ROI）框以选择目标区域。选定所需的感兴趣区域后，单击底部的“添加点”按钮，成像点列表将自动生成。

现在，单击“采集”以开始成像并获取原始图像数据。通过单击桌面图标启动 HTX 处理服务器。将原始图像文件拖放到 HTX 处理服务器中。

单击“处理”以从原始图像文件生成TCF文件。通过单击桌面图标启动TomoAnalysis Viewer。通过将处理后的TCF文件拖放到查看器窗口中来加载文件。

双击文件缩略图以打开 ROI 断层图像。通过使用缩放、平移和滚动控件在 X、Y、Z 平面中导航，来查看二维视图。单击左侧的最大强度投影（MIP）渲染视图图标，切换至三维渲染模式。

通过旋转、缩放和平移图像来浏览三维视图。对于基于机器学习的图像分割，将 TCF 图像文件导出为 HDF5 格式，以确保数据为多维格式，与 ilastik 兼容。打开 ilastik 并导航至新建项目。

在“分割工作流程”部分选择像素分类，并将项目保存到指定文件夹中。要加载 HGF5 文件，请转到“输入数据”选项卡，点击“添加新文件”，选择相应的 H5 数据集，并确认图像通道分配正确。接着，转到“特征选择”选项卡，选择颜色、强度、边缘和纹理等特征，以优化分割效果。

在“训练”选项卡中，使用不同颜色的画笔标记类器官和非类器官区域。点击“实时更新”以预览分割结果，并根据需要进行调整。完成后，进入“预测导出”选项卡。

选择“简单分割”作为导出标记预测结果的来源，然后单击“全部导出”。根据分析需求，将导出格式设置为 H5 或 TIFF。进行定量分析时，请打开补充代码文件 2。

在脚本中指定掩膜文件及其对应TCF文件的正确文件夹路径。运行代码以启动定量分析。该代码将计算每个数据集的类器官体积、蛋白质密度和总蛋白质含量。

该图展示了用于可视化小肠类器官整体形态的高分辨率三维折射率重建结果。重建图像揭示了在三种不同光学切片深度下，对照处理组与顺铂处理组类器官之间明显的结构差异。与处理后10分钟的对照组类器官相比，顺铂处理组类器官表现出显著增大的体积、较低的蛋白密度以及更高的总蛋白含量，表明其早期即出现结构肿胀及蛋白组成改变。

24小时的延时成像显示，对照剂处理的类器官保持了结构完整性，而顺铂处理的类器官则出现进行性结构退化，包括隐窝塌陷和细胞解离增加，提示存在时间依赖性的细胞毒性损伤。定量追踪证实，对照剂处理的类器官随时间推移体积和蛋白含量均有所增加，而顺铂处理的类器官在这两个参数上均呈现时间依赖性下降，表明顺铂抑制了生长并诱导了细胞降解。在24小时期间，对照剂处理的类器官蛋白密度保持稳定，而顺铂处理的类器官蛋白密度则进行性降低，提示细胞结构破坏以及因细胞脱落导致的细胞外间隙增加。