人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

我们的研究探讨了单核细胞和巨噬细胞谱系，强调其显著的可塑性以及整合微环境中多种信号的能力，从而在炎症、组织修复和感染过程中调控效应反应。巨噬细胞分布于全身，协调先天免疫和适应性免疫的启动与消退，影响保护性免疫及免疫介导的病理过程。巨噬细胞的重编程是该领域最具前景的研究方向。

新兴的组学技术极大地革新了我们对巨噬细胞生物学的理解，使我们能够深入了解这些细胞的表型多样性、功能特征、可编程潜力及其发育起源。目前在巨噬细胞分化与极化研究中存在的主要障碍和陷阱，是文献中实验条件和操作方案的高度异质性，以及在定义“巨噬细胞”这一术语方面缺乏共识。我们展示了药物和脂质介质对巨噬细胞极化的重编程作用，并建立了巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞相互作用的体外三维模型。

此外，我们已证明血小板可促使单核细胞来源的巨噬细胞分化为 N1 表型。首先，将抗凝外周血样本置于离心机中，在室温下以 200G 离心 15 分钟。

观察血小板富集血浆位于上层，细胞组分（包括红细胞和白细胞）位于下层。将第一次离心获得的细胞组分用预热至室温的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。在进行Ficoll-Hypaque密度梯度离心前，轻轻混匀溶液。

将15毫升Ficoll-Hypaque转移至无菌的15毫升离心管中。小心且缓慢地将30毫升稀释血液加至Ficoll溶液上方，确保两相之间尽可能减少混合。将含有Ficoll和稀释血液的离心管在室温下以600G离心25分钟。

使用无菌的3毫升巴斯德吸管，移除部分黄色上层。用无菌巴斯德吸管小心收集黄色层与菲科尔层之间的界面。将收集到的外周血单个核细胞（PBMCs）转移至含有至少3毫升无菌PBS的新15毫升离心管中。

用无菌 PBS 补充至试管，使总体积达到 12 至 15 毫升。然后在 600G 条件下离心 10 分钟。接下来，在 8 至 10 摄氏度下以 300G 离心 5 分钟，沉淀 PBMC 悬液。

用含有2% FBS的无菌冷PBS重悬细胞，并将细胞置于4°C直至下一步操作。将所需体积的PBMC悬液转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中。

然后，每 100 微升细胞悬液中加入 10 微升阳性选择混合液。充分混匀悬液后，在室温下孵育 15 分钟。接着，每 100 微升细胞悬液中加入 10 微升磁性纳米颗粒。

用力吹打混悬液5次以上，确保磁性纳米颗粒均匀悬浮。室温孵育10分钟后，向悬液中加入含FBS和EDTA的PBS，使总体积达到2.5毫升。轻柔吹打细胞2至3次。

将试管插入磁力分选器中，静置五分钟。以连续动作将磁铁连同试管一起翻转。保持磁铁和试管倒置两到三秒，然后将其恢复至直立位置。

将离心管从磁铁上取下，然后再次向管中加入 2.5 毫升 PBS-FBS-EDTA 缓冲液。轻轻吹打细胞悬液上下 2 至 3 次以混匀。将离心管重新插入磁铁中，并静置 5 分钟。

一次性连续操作，再次倒置磁铁和离心管，弃去上清液。将离心管从磁铁上取下，用适当体积的不含EDTA的PBS-FBS重悬细胞。此时，阳性筛选的细胞已可直接使用。

向分选后的CD14细胞中加入PBS-FBS缓冲液，使总体积达到12至14毫升，以稀释残留的EDTA。在600×g下离心10分钟。弃去上清液后，将经阳性筛选的CD14单核细胞重悬于2毫升PBS-FBS缓冲液中。

使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。在培养前将细胞保持在冰上。进行培养时，将细胞沉淀重悬于补充的 RPMI 1640 培养基中，浓度为每毫升一百万个细胞。

将250微升制备好的细胞悬液移液至48孔板的每个孔中。向每孔加入250微升含有50纳克/毫升巨噬细胞集落刺激因子的抗生素补充RPMI培养基。将细胞培养板置于湿润培养箱中孵育，以启动巨噬细胞分化。

在巨噬细胞分化第四天，更换每孔中一半的培养基。加入细胞因子或试剂以建立所需的极化条件，并继续培养三天。在第七天收集由巨噬细胞衍生的单核细胞，用于表型鉴定。

由干扰素γ联合脂多糖诱导的M1型巨噬细胞表现出CD64的最高表达水平，不表达CD206，并且CD163和MERTK的表达水平较低。由白细胞介素4诱导的M2a型巨噬细胞特征为CD206表达升高，而CD64、CD163和MERTK的表达水平降低。由白细胞介素10或地塞米松诱导的M2c型巨噬细胞表现出CD163和CD14表达增加，CD64呈中等水平表达，并且MERTK表达上调。