延时活体成像及快速树突分支动态在发育期 Drosophila 神经元中的定量分析

本方案提供了一种利用活细胞延时成像和三维图像标注软件来定量分析树突分支结构及发育中神经元分支动态的新方法。该技术可对分支末端进行成像与追踪，为测量树突丝状伪足的动态行为提供了一种快速且高效的方法。采用此方法的研究有助于深入理解发育过程和神经活动如何调控树突的形态发生。

我们的方法适用于体外和体内环境中稀疏标记的神经元。进行该操作时，请注意必须仔细调整成像参数，以获得足够的时间和空间分辨率。在解剖幼虫果蝇脑组织时，应在解剖显微镜下使用一对5号标准尖头解剖镊固定幼虫样本，同时用另一对镊子小心地分离出脑组织，保留眼盘、脑叶以及腹神经索。

然后去除附着的肌肉，以尽量减少成像过程中样本的移动。当所有脑组织采集完毕后，使用真空脂在玻璃载片上勾勒出一个方形腔室，并向腔室内加入 20 微升外部生理盐水溶液。用镊子将脑组织转移至腔室中，并在显微镜下调整脑组织的位置，使其背侧朝上。

用玻璃盖玻片覆盖样品室，并轻轻按压盖玻片，以减少成像过程中样品的漂移。为识别含有单标记神经元的脑组织外植体，在解剖后30分钟内，选择40倍水浸物镜和落射荧光光源。选用调谐至920纳米的双光子激光器和非Dscan探测器，设置成像参数为每帧512×512像素，每个Z轴堆栈采集时间为1分钟，持续成像10分钟。

然后，调整光学和数字变焦，以在确保一分钟内覆盖整个树突树的同时，达到足够的 X、Y、Z 分辨率。该设置生成的图像典型分辨率为 0.11 × 0.11 × 0.25 微米。为进行漂移校正，在合适的漂移校正软件程序中打开目标文件，点击“编辑”和“编辑显微参数”。

如果存在双光子选项，则将显微镜类型设置为宽场（Wide Field）以获取双光子图像，并按照软件定义的工作流程进行操作。进行去卷积时，在去卷积软件中打开经过漂移校正的图像，并遵循相应的工作流程。然后，将去卷积后的图像保存为后续图像标注软件所支持的文件格式，该软件需能够分析4D数据并报告图像中指定斑点的空间坐标。

进行图像标注时，使用图像标注软件打开去卷积后的图像，在三维空间中检查并标记所有时间点的分支尖端。图像标注软件将报告并存储所标记分支尖端的空间和时间坐标。将坐标信息导出为 CSV 文件，用于后续计算。

在“斑点”模块中，单击“跳过自动创建”，选择“手动编辑”，并勾选“自动连接到选定斑点”复选框。浏览时间序列中的各帧图像，选择一个分支进行标注。按住 Shift 键，单击分支末端的顶端以添加斑点。

然后，点击“统计”选项卡，选择“详细”、“特定值”和“位置”。记录的空间和时间坐标信息将被显示。点击“保存”以将数据导出为 CSV 文件。

为了计算三维空间中分支末端的位置，将 CSV 文件作为电子表格打开，并选择“Track ID”列。点击“从小到大排序”，并确认“扩展所选区域”。排序后，每个唯一的树突分支将由 Track ID 标识，同一分支上的点具有相同的 Track ID。“时间”列将存储不同时间帧的信息。

在电子表格中添加“距离”列，并利用坐标计算每两个时间上相邻的点之间的距离。为了测量单个体素水平的微小移动，将所有小于0.3微米的距离值重置，以过滤任何未校正的漂移或不完美的图像标注。接下来，创建“位移”列，并将“距离”列中的数值复制到“位移”列中。

手动为每条分支尖端指定延伸和回缩事件。若为延伸事件，则保持正向位移值不变；若为回缩事件，则将相应的位移值改为负值。

然后，在一个新的事件列中，对单个延伸和回缩事件的位移值进行求和。在本视频中，可以观察到从一个具有代表性的单标记腹外侧神经元采集的最大强度投影图像序列。单帧图像可用于评估回缩和延伸事件。

半自动化的4D追踪技术可对单个标记的腹外侧神经元的动态分支末端进行标注，如图所示。通过计算每个时间点分支移动的方向和距离，可以比较不同发育阶段单个标记的腹外侧神经元的树突分支动态特性。最关键的步骤是在解剖和制片过程中保持脑组织和树突形态的完整性。

原始图像序列的质量对于成功的追踪和定量分析也至关重要。利用该技术，我们能够对发育中的果蝇中枢神经元的树突丝状伪足进行定量分析，并进一步探究与树突成熟及突触形成相关的分子机制。