福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星DNA基因分型与流式细胞术倍性分析

本基因分型方案的主要优势在于可最大程度减少母体DNA的污染，而母体DNA污染是检测福尔马林固定、石蜡包埋的葡萄胎组织时面临的主要挑战。流式细胞术是一种快速且经济的方法，可显著促进葡萄胎的诊断。对于每一份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的妊娠产物样本，应按照本视频所述制备厚度为四微米的苏木精-伊红染色切片，用于显微镜下的形态学评估。

将FFPE组织块置于冰上15分钟，以利于切片。调整切片机，切取厚度为4 µm的切片用于显微镜下形态学评估。将冷却的组织块放入切片机中，从每个组织块切取一张切片用于苏木精-伊红（H&E）染色。

用镊子将每个切片转移至 45 °C 的水浴中。用已用铅笔标记好样本编号的带正电荷载玻片从水浴中捞起切片。将带有切片的载玻片放入 65 °C 的烘箱中，使切片牢固黏附于载玻片上。

将载玻片置于烘箱中孵育25分钟。进行H&E 将切片浸入相应染色缸中，按照文本方案中列出的时间进行染色。使用封片介质对四微米切片进行封片，用于形态学分析。

用盖玻片覆盖。利用 H&E 切片和光学显微镜，选择含有最多绒毛组织的 FFPE 组织块；如果可能，应选择绒毛组织与母体组织分离且未混杂的组织块。

将切片机调整至切取厚度为10微米的切片，用于DNA提取。根据组织块中绒毛组织的量，切取10至30张切片。如前所述用载玻片收集切片后，将带有切片的载玻片置于65°C的烘箱中，使切片牢固附着于载玻片上。

将载玻片置于烘箱中孵育20分钟。进行H&E 将载玻片浸入相应染色缸中，按照文本方案中列出的时间进行染色。将载玻片置于通风橱内至少三小时，以使有毒的二甲苯气味充分挥发。

使用镊子从湿润的纸巾上撕下一小片。在立体显微镜下，利用镊子和经水润湿的小片纸巾，轻轻刮除苏木精-伊红染色的10微米厚切片上所有不需要的母体组织。此步骤的关键在于耐心，尤其是对于较难处理的组织块。

此外，还应由其他人进行检查，以确保没有遗漏母体组织。现在，从湿润的擦拭纸上撕下新的一片，用它来收集绒毛组织。将带有附着绒毛组织的擦拭纸片放入已标记的1.5 ml离心管中。

尽量减少此步骤中使用的纸巾量，因为使用过多可能会堵塞DNA提取柱，从而降低最终收集到的DNA量。按照FFPE试剂盒的DNA提取方案进行DNA提取。使用实验室分光光度计，加入1 µL DNA，于216 nm处测定吸光度以进行定量。

取1微升DNA样品加入2%琼脂糖凝胶中，在80至100伏电压下进行琼脂糖凝胶电泳，用于定性分析。根据DNA评估结果，确定用于多重短串联重复序列PCR扩增的DNA用量，建议使用不少于1000纳克的DNA。

按照文本方案中所述，进行PCR扩增、毛细管电泳和数据分析。为选择理想的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，使用光学显微镜观察苏木精-伊红（H&E）染色切片，挑选其中约50%至70%组织成分为绒毛组织的FFPE组织块。对于绒毛组织含量不理想的组织块，可在切片过程中对绒毛组织进行富集。

为此，根据相应的H&E切片确定新鲜切割组织的哪一侧含有更多的绒毛膜绒毛，然后使用刀片切去需要丢弃的另一侧，以富集绒毛膜绒毛。为获得最佳的FFPE包埋块切片效果，使用切片机切割四张厚度为50 µm的切片。

若无法获得理想的FFPE组织块，仍应尽量保持绒毛组织与母体组织的比例。例如，如果组织块中仅有30%为绒毛组织，其余部分为母体组织，则应去除至少一半含有母体组织的切片，并通过增加切片数量进行补偿。将切片置于已标记的15 mL离心管中。

进行脱蜡和复水时，应在通风橱中操作，按照文本方案中列出的时间依次加入每种试剂，并等待相应时间。然后使用巴斯德吸管通过真空抽吸去除试剂。接着，向15 mL离心管中加入4°C的柠檬酸溶液。

将溶液置于80摄氏度水浴中两小时后，使其冷却至室温。用真空抽滤去除柠檬酸溶液。加入6毫升1x PBS缓冲液，涡旋混匀，静置1至2分钟，使组织沉降至管底。

如有需要，将样品在1000 RPM条件下离心30秒。用真空抽吸法去除1X PBS。随后加入1 mL预热的胃蛋白酶溶液，置于37摄氏度干浴中孵育30分钟。

每10分钟涡旋一次。在此孵育的最后10分钟内，配制碘化丙啶-核糖核酸酶A溶液。再加入6 mL的1×PBS，涡旋混匀，静置1至2分钟，使组织沉降至管底。

再次用真空抽吸法移除 1x PBS。加入 550 µL 碘化丙啶-核糖核酸酶 A 溶液，将样品置于 37 °C 干浴中孵育 30 分钟。用镊子将一块 5 cm × 5 cm 的 48 µm 滤膜置于聚苯乙烯圆底管的上部，用于流式细胞仪检测。

用移液管将液体通过滤网过滤至离心管中。样品现可进行流式细胞仪检测。在准备上机前，需用铝箔包裹避光保存。

最后，按照文本方案中所述进行流式细胞术及数据分析。对部分性葡萄胎进行微卫星基因分型，同时分析患者及其配偶的DNA，结果显示该患者的葡萄胎为三倍体双精子来源。第一个标记位点在妊娠产物中显示出两个峰。

第一个峰来自母亲，因为只有母亲具有这种大小的峰。根据相同的推理，第二个峰来自父亲，因为他携带相同的等位基因。注意第二个峰明显高于第一个峰，表明该峰中可能含有两份相同的父源等位基因。

该妊娠产物中的母体污染非常轻微，因为在第二个母源等位基因位置仅显示一个极小的峰。第二个位点在妊娠产物中显示出三个峰，其中两个峰来自父亲，一个峰来自母亲。

第三和第四个位点与第一个位点相似，同样显示有两个等位基因来自父亲，一个来自母亲。由于所有四个位点均一致显示存在三个等位基因，其中两个来自父亲，一个来自母亲，因此可以得出结论：该妊娠产物为双精子受精型三倍体，确诊为部分性葡萄胎。在解读基因分型结果时，必须结合清洗步骤中所记录的备注，充分考虑样本污染的程度。

在某些情况下，采用上述两种方法仍无法得出结论。此时，我们会使用其他方法，例如荧光原位杂交（FISH），以揭示真实的基因型。微卫星基因分型技术实现了对葡萄胎的精确诊断，并为进一步理解与不同类型葡萄胎特征相关的基因型奠定了基础。