利用生物活性珊瑚基质增强解离神经细胞培养的持久性

本方案的意义在于提供了一种新方法，可增强神经元、胶质细胞和干细胞在体外的存活能力与生长特性，同时也适用于其他类型的细胞。该技术的主要优势在于使用了由珊瑚骨架制成的基质。

这种基质可滋养并保护神经细胞，同时促进其再生。由于对体外神经细胞具有支持作用，珊瑚骨架或可作为脑损伤部位的再生植入物发挥类似功能。首先，使用锤子将珊瑚骨架敲碎，分割成0.5至2厘米的碎片。

为了溶解有机和无机残留物，将珊瑚骨骼碎片浸泡在10%次氯酸钠溶液中10分钟。然后用重蒸水洗涤一次。为去除残留的有机物，将碎片浸泡在1摩尔氢氧化钠溶液中5分钟，再用重蒸水洗涤一次。

通过将碎片浸泡在30%过氧化氢溶液中10分钟，继续去除有机沉积物，并用双蒸水清洗碎片三次。尽可能去除多余的双蒸水，将珊瑚碎片置于通风橱中晾干。然后通过将盖玻片浸泡在100毫米玻璃培养皿中的10毫升95%乙醇中来清洗盖玻片。

15分钟后，除去乙醇，并用双蒸水洗涤三次，每次洗涤间隔10分钟。除去双蒸水后，将培养皿置于80°C预热的加热板上。然后轻轻搅拌盖玻片，直至双蒸水完全蒸发。

将盖玻片进行高压灭菌。使用研钵和研杵研磨珊瑚骨骼碎片，直至完全破碎。得到粒径范围为20至200微米的颗粒混合物。

或者，使用刀片长度为六厘米、宽度为0.5至一厘米的电动研磨机，以每分钟1000转的速度研磨珊瑚骨骼碎片30秒。为纯化颗粒，将颗粒转移至电动40微米滤网筛中。调节电动筛分仪的设置，使其以每分钟600次振幅的速度振动，并以每秒六次的频率弹跳。

然后对颗粒进行高压灭菌。在无菌条件下，将珊瑚骨骼颗粒加入浓度为每毫升20微克的PDL中，溶解于Hank's溶液，使颗粒浓度达到每毫升PDL溶液含5毫克或10毫克颗粒。按每25平方厘米约2毫升的量将溶液分装至培养瓶和培养皿中，并在4摄氏度下孵育过夜。

颗粒下沉并附着于底部。第二天，用无菌的双蒸水将烧瓶和培养皿清洗一次。将烧瓶和培养皿置于超净台中晾干。

为了包被玻璃盖玻片，首先将珊瑚骨骼颗粒以每毫升5或10毫克的浓度加入双蒸水中。将盖玻片置于预热至80摄氏度的加热板上。然后取40微升颗粒溶液滴加在盖玻片中央，静置15分钟使其完全蒸发。

这将导致颗粒附着在盖玻片上。将包被好的盖玻片进行高压灭菌，并在无菌条件下保存。接下来，将盖玻片放置于无菌24孔板的盖子上，每张盖玻片上加入100 µL浓度为20 µg/mL的PDL溶液。

用移液枪头确保液体覆盖整个晶粒区域及盖玻片的其余表面。用培养皿底部盖住盖玻片，再用封口膜包裹培养皿四周。在 4°C 条件下孵育过夜。

第二天，用双蒸水将盖玻片清洗一次，并在通风橱中晾干。准备好新生大鼠头部后，用大镊子夹住其口腔固定，用小剪刀剪开覆盖颅骨的皮肤。

使用干净的剪刀，在小脑侧方颅骨下方插入，向右和向左剪开颅骨，以便将其移除。用小型镊子将颅骨从脑组织上剥离。将脑组织与头部分离，并放入含有2毫升冷MEM的60毫米培养皿中。

在体视显微镜下，使用两把小镊子分离海马体。将海马体转移至预先准备好的含有MEM的35毫米培养皿中。使用手术刀将海马体切成约1毫米厚的切片。

加入200微升胰蛋白酶溶液。轻轻混匀，并在37摄氏度、5%至10%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，向培养皿中加入2毫升冷MEM培养基以灭活胰蛋白酶。

然后使用最大直径的玻璃巴斯德吸管，将消化后的组织转移至含有1毫升预热至37°C的第一天培养基的15毫升离心管中。用最大直径的玻璃吸管反复吹打组织10到15次进行吹打分散。随后，换用中等直径的玻璃吸管重复此操作。

使用最小直径的移液管继续进行研磨。避免产生气泡以减少细胞死亡。让解离的组织块沉降两到五分钟。

然后将上清液转移至另一个15毫升离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。调整细胞密度至每毫升200,000至400,000个细胞的适宜范围。

使用第一天培养基进行稀释。随后，将100微升细胞接种到每块盖玻片上。确保细胞覆盖整个盖玻片表面。

在37摄氏度及5%至10%二氧化碳条件下孵育。次日，向各孔中加入500 µL神经元生长培养基。使用镊子，通过倾斜盖玻片的方式移除第一天的培养基，并将每张盖玻片轻轻转移至相应的孔中。

吸去盖子中残留的培养基。将培养板置于37摄氏度、5%至10%二氧化碳条件下孵育。通过在孵育箱底部放置盛水托盘，保持孵育箱内最大限度的湿度。

不要更换培养基。在此条件下，培养物可维持长达一个月。本研究中，手动研磨和电动研磨机均获得相似结果，得到的颗粒混合物大小在20至200微米之间。

手动或电动筛分器产生了两种类型的颗粒混合物：一种颗粒大小在40至200微米之间，另一种颗粒大小为40微米或更小。相差显微照片显示，在有或无基质的情况下，海马神经元细胞在涂有珊瑚骨骼颗粒的盖玻片上培养均可形成复杂的神经元网络。

细胞核染色显示，接种14天后，基质上的细胞密度高于未包被的盖玻片。微管相关蛋白2染色表明，与对照组相比，基质上形成了复杂的神经元和树突网络。此外，利用胶质纤维酸性蛋白标记的在珊瑚骨架基质上培养的胶质细胞表现出显著的形态学变化。

它们呈现出比在对照基质上生长的胶质细胞更明显的棘状形态，并具有更长的突起，而在对照基质上，胶质细胞则显得更圆、更扁平。在分离细胞时，务必注意操作迅速，必要时通过添加CO2维持pH，并尽可能轻柔操作，以防止珊瑚颗粒脱落。