NF-κB依赖性荧光素酶激活及基因表达定量 沙门氏菌 感染的组织培养细胞

该方案适用于检测表达NF-kappa-B荧光素酶报告基因的细胞中NF-kappa-B活化状态的变化。此技术的主要优势在于可对导致NF-kappa-B活化改变的因素或条件进行高通量筛选。NF-kappa-B是一种参与多种细胞过程的转录因子。

NF-κB 的一个众所周知的功能是通过诱导多种细胞因子和趋化因子的表达来启动炎症反应。我们实验室特别关注由病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）诱导的 NF-κB 激活。在此，我们使用了稳定转染了 NF-κB 萤光素酶报告质粒的 HeLa 细胞系。

也可利用其他细菌，甚至病毒或化学化合物，在该细胞系中研究 NF-kappa-B 的激活。如果能够将 NF-kappa-B 荧光素酶报告质粒导入其他细胞系，则也可使用这些细胞系。初次进行该实验的研究人员可能在正确使用细胞培养和细菌操作所需的无菌技术方面遇到困难。

细胞刺激前一天，吸出已生长至约75%汇合度的HeLa 57A细胞的培养基。用一毫升0.05%胰蛋白酶EDTA洗涤细胞。更换为另一毫升胰蛋白酶EDTA，将培养瓶转移至37摄氏度培养箱中孵育五分钟。

细胞从培养瓶中脱离后，将其悬浮于10毫升培养基中。取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合，吹打混匀，再转移10微升至细胞计数板。使用细胞计数仪对悬液中的细胞进行计数，并用培养基将细胞稀释至最终浓度为每毫升2.5 × 10⁵个细胞，置于50毫升锥形管中。

将250微升细胞悬液转移至48孔板的每个孔中。定期盖紧并翻转锥形管，以确保细胞悬液均匀。轻轻敲击培养板侧面，确保细胞在孔中均匀分布。

将培养板转移至37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中，过夜培养使细胞贴壁并生长。将冻存的沙门氏菌划线接种于LB琼脂平板上，以获得单菌落。将平板转移至37摄氏度的培养箱中，过夜培养。

第二天，向无菌细菌培养管中加入 3 mL LB 培养基，并向培养基中加入适当的抗生素。使用无菌接种环，从划线培养的细菌平板上挑取单个菌落，并将接种环接触 LB 培养基。接种后盖好管盖，并丢弃接种环。

将试管放入设置为37摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中，使细菌过夜培养。次日早晨，从培养箱中取出过夜培养的细菌菌液。通过向每管中加入3毫升新鲜LB培养基和抗生素，准备用于传代培养的试管。

将30微升过夜培养的细菌培养物转移至 freshly prepared 培养基中。将试管置于37摄氏度的摇床培养箱中培养三小时。三小时培养后，取1毫升无菌LB肉汤加入塑料比色皿中，作为空白对照。

将900微升LB培养基转移至其他将用于样品分析的比色皿中。取100微升细菌亚培养物加入含有900微升LB培养基的比色皿中，并上下吹打数次以混匀。对每种细菌悬液重复此操作。

打开分光光度计，用于在600纳米波长下测量细菌培养物的光密度。将空白对照放入分光光度计中，并注意其方向。

关闭盖子，按下分光光度计上的空白对照按钮，获取背景吸光度。将空白比色皿替换为待测样品比色皿，保持相同方向，然后按下读数按钮。记录这些样品的OD600值。

将该数值乘以 10 以校正稀释倍数。在比色皿中将菌悬液按 1 比 10 稀释后测定吸光度，其值应约为 0.1，大致相当于每毫升 1 × 10⁹ CFU。在新的离心管中，加入适量稀释后的过夜培养液至新鲜 LB 培养基中，制备浓度为 1 × 10⁸ CFU/mL 的菌悬液，作为接种物使用。

通过将50微升细菌悬液转移至含有450微升无菌PBS的离心管中，对接种物进行连续稀释，直至获得每毫升约100 CFU的终浓度。取每毫升100和1000 CFU这两个最低稀释度的悬液各100微升，分别接种到两块LB琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布以获得单菌落。将这些平板转移至37摄氏度培养箱中，过夜培养。

第二天，计数菌落并计算初始接种物的细菌浓度，以确定实际的接种浓度。同一天，根据每个孔将使用的感染条件标记平板盖子，每种条件设三个重复。向相应的孔中加入 10 µL 接种物，向未感染的对照孔中加入 10 µL 无菌 LB 培养基。

为了同步感染时间，将培养板放入台式离心机中，在500 × g 条件下离心5分钟，并确保培养板已平衡。随后，将感染的细胞转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。取一支15 mL锥形管，其中含有分装的细胞培养基，放入37 °C水浴中预热，以用于下一步操作。

感染后一小时，从水浴中取出含有细胞培养基的15毫升锥形管，并用70%乙醇擦拭管外表面。将组织培养板从培养箱转移至生物安全柜中。使用无菌吸头吸去孔中的培养基，并更换为250微升新鲜的温热细胞培养基。

将培养板放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中继续孵育额外四小时。之后，从二氧化碳培养箱中取出培养板，吸去各孔中的培养基。进行荧光素酶分析时，向各孔中加入100微升1X细胞裂解缓冲液。

将培养板转移至负80摄氏度冰箱中，孵育至少30分钟，以确保细胞充分裂解。随后，将含有冷冻细胞裂解液的培养板置于实验台解冻，并根据生产商的建议配制荧光素酶底物试剂。使荧光素酶底物试剂平衡至室温。

接下来，打开酶标仪并启动相应的读板软件。将仪器设置为检测发光信号。将每种细胞裂解液各10微升转移至不透光的96孔板的孔中。

使用多通道移液器，向不透明白板的每个孔中加入 50 µL 荧光素酶检测试剂。轻轻侧向敲击板子以混匀各孔，确保底部表面被液体覆盖。将板子放入酶标仪中并开始读数。

将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。本实验方案重点研究转录因子NF-kappa-B的激活，采用稳定转染了NF-kappa-B依赖性荧光素酶报告基因的HeLa细胞系。该图展示了在感染鼠伤寒沙门氏菌不同菌株的HeLa 57A细胞中，NF-kappa-B依赖性荧光素酶激活和IL6基因表达的代表性实验结果。

野生型SL1344菌株感染在RLU和IL6表达中均诱导出强烈的荧光素酶信号，而感染sipA sopB sopE2三重突变株后信号减弱，并在感染sipA sopB sopE2 sopE四重突变株后降低至对照水平。进行连续稀释和涂板时需格外注意，以确保各菌株间的接种量保持一致。

在确定参与 NF-κB 激活及下游 mRNA 表达变化的因素后，可采用蛋白质印迹技术（western blot）来检测蛋白质表达水平的改变。本实验方案不仅使我们实验室能够评估沙门氏菌诱导的 NF-κB 激活，还可用于研究其他与 NF-κB 激活相关的化合物和蛋白质。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种人类病原体。

处理这些细菌时应穿戴适当的个人防护装备。