通过改良的基因表达谱分析方法从谷物种子中获取高质量转录组数据

这种微阵列杂交方法适用于对具有已知基因组的生物体的大量样本进行比较。与高通量测序方法相比，该方法产生的数据量更易于处理，并且分析成本更低。本实验操作将由德国加特尔斯莱本IPK研究所Rosis研究小组的博士后科学家Dr. Christiane Seiler进行演示。

使用基因表达杂交试剂盒进行微阵列杂交前，根据生产商说明书配制10X封闭剂，并将制备好的封闭剂分装为200微升每份。随后将封闭剂于-20摄氏度保存至使用。在微阵列杂交当天，将一份200微升的10X封闭剂置于冰上解冻，并将杂交 oven 预热至65摄氏度，同时将加热块预热至60摄氏度。

按照制造商的说明为每个样本配制片段化反应液，并在涡旋振荡器上轻轻混匀样本。涡旋混匀后，在微量离心机中短暂离心样本，随后在60摄氏度的加热块中准确孵育30分钟。孵育结束后，立即将每支离心管置于冰上冷却1分钟，然后加入25 µL 2倍基因表达杂交缓冲液（每管高速振荡混匀）以终止片段化反应。

轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡，并在室温下离心管中样品。离心结束后立即将所有管子置于冰上，并尽快将每个样品加载到微阵列玻片中。接下来，缓慢将每种杂交混合液各44 µL加入每个密封垫圈孔的中心，注意避免引入气泡；对于未使用的孔，加入44 µL杂交缓冲液。

立即将微阵列芯片以正确的方向放置在垫圈玻片上，注意不要洒出任何液体，并紧密关闭杂交组件。旋转组件以确认无静止气泡存在，然后将杂交腔室组件放入杂交炉的旋转器中。将旋转速度设为每分钟10转，随后在65摄氏度下开始杂交，精确持续17小时。

在样品杂交的同时，根据表格中的说明，在相应的洗涤缓冲液中准备好三个洗涤皿组件。杂交恰好进行17小时后，在铺有无绒纸的实验台面上拆卸一个杂交室，将一个微阵列夹心结构转移至盛有第一种洗涤缓冲液的培养皿中，微阵列条形码朝上，呈倾斜位置放置，不要将整个玻片完全浸入缓冲液中。用镊子将两张玻璃玻片分开，同时牢固握住微阵列玻片，使垫圈玻片轻轻滑落至培养皿底部。

缓慢地将微阵列玻片侧向提起，立即转移至第二个培养皿中的微阵列架上，尽量减少暴露在空气中的时间。当全部八张玻片均匀放置在架上后，安装架固定器，并将整个第二个培养皿装置转移至磁力搅拌器上。轻轻搅拌，持续时间恰好为一分钟。

在搅拌样品的同时，将培养皿三从37摄氏度的培养箱中取出，转移至第二个磁力搅拌器上。然后轻轻将37摄氏度的洗涤缓冲液二加入培养皿三中，避免产生气泡。搅拌孵育结束后，缓慢而轻柔地将载玻片架转移至培养皿三中，并取下架托。

精确搅拌一分钟后，缓慢轻柔地将载玻片架从培养皿中取出，使用无绒纸仔细擦干每张载玻片的两侧，并在干燥后立即将每张载玻片放入载玻片盒中。待载玻片干燥15分钟后，将每张微阵列载玻片转移至载玻片架中，使条形码朝上，然后将组装好的载玻片架装入扫描仪转盘，并按条形码编号顺序排列。随后立即对载玻片进行扫描。

本图展示了一次检测RNA提取质量的典型实验结果。在对低淀粉含量样品（如大麦叶片）进行常规分析时，可观察到来自叶绿体的额外核糖体RNA条带。而高淀粉含量样品（如大麦种子）则显示出18S和28S核糖体RNA。

请注意，由于叶绿体核糖体RNA的存在，无法为绿色植物组织（如叶片样品）计算自动化的RNA完整性数值。在此代表性分析中，按照所示方法进行了RNA制备并杂交至定制的大麦微阵列芯片。网格图显示了来自芯片每个角落的衍生信号示例，包括用于校准的背景和 spike-in 读出点。

直方图显示了具有相应信号强度的可检测点的偏差情况。如图所示，成功的杂交会产生一条宽广的高斯型曲线，且仅有少量离群值。此处展示的是检测信号的质量控制报告。

杂交玻片的数值列在第二列中，可接受数值的范围显示在第四列中。该方法可用于任何实验体系，适用于基因组信息较为丰富的任何生物。在本实验室中应用该技术，使我们能够比较和分析水稻与大麦在生长胁迫诱导后发生的转录组变化。