利用分裂荧光素酶检测系统筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂

HBX-DDB1 相互作用是促进从 cccDNA 进行 HPV 转录的关键步骤，因此本方案可能成为发现 HPV 功能性治愈新型治疗药物的重要工具。我们的操作流程简单，仅需较短时间即可完成筛选。我混合的相互作用可实时检测，无需进行细胞裂解。

此外，筛选质量令人满意，Z' 因子得分较高。抑制 HBX-DDB1 相互作用可恢复 Smc5/6 的功能，从而抑制 HPV 的转录、蛋白表达以及 cccDNA 的产生。这种新型的抗病毒作用机制有望克服现有 HPV 疗法的不足之处。

蛋白质-蛋白质相互作用是一类重要的药物靶点。本文所述基于分裂荧光素酶的检测方法，旨在靶向病毒与人源 heparan sulfate（hasS）蛋白之间的相互作用，可能为其他传染病的治疗提供新的策略。尽管本实验方案简单易懂，但若无直观的视觉演示，某些步骤可能较难重复。

因此，可视化演示将有助于理解本实验方案。首先，将5 × 10⁵个HEK293T细胞接种至含10毫升DMEM的100毫米培养皿中，于37°C孵育过夜。次日，分别取1微克表达HBx-LgBit和SmBit-DDB1的DNA质粒以及DNA浓缩缓冲液，加至总体积为300微升。

加入16微升增强剂溶液，通过涡旋振荡1秒混匀各管。室温孵育样品3分钟，然后加入60微升转染试剂。涡旋振荡管子10秒，再将样品孵育8分钟。

同时，吸去培养皿中的细胞培养基，加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PVS）洗涤细胞。吸去 PVS，加入 7 mL DMEM 培养基。向含有转染复合物的离心管中加入 3 mL DMEM 培养基，用移液器吹打混匀，然后将混合液加入细胞中。

然后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10小时。孵育结束后，弃去用过的培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。弃去PBS，加入1毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37摄氏度孵育细胞以使其脱落。

接下来，加入 4 mL DMEM，通过移液枪在细胞层表面反复吹打数次以分散培养基，然后将悬液转移至离心管中。以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再用 1 mL PVS 重悬细胞沉淀。重复离心并弃去上清液。

然后，用添加了10%胎牛血清（FBS）的缓冲细胞培养基重悬细胞沉淀，调整接种密度至每毫升一百万个细胞。将50微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，并将细胞放回37°C培养箱中孵育10小时。在细胞孵育的同时，将筛选化合物及其溶剂稀释至13.5倍浓度。

向每个孔中加入 12.5 µL 发光底物，在室温下孵育 5 分钟。使用化学发光仪测定基础发光值，随后立即向每个孔中加入 5 µL 化合物和对照 DMSO。每 30 分钟测定一次发光值，持续 2 小时，然后与 DMSO 处理组比较，计算化合物的抑制效应。

测定基础发光信号，计算得到信噪比大于80。Z'因子大于0.5，表明该检测系统适用于高通量筛选。通过设定相对于仅含DMSO对照组的抑制率阈值为大于40%，筛选出硝唑尼特作为候选药物。

我们此前通过使用该方法筛选一个反应性小规模化合物文库，鉴定出硝唑尼特可抑制HBX-DDB1相互作用。利用硝唑尼特，我们证实抑制HBX-DDB1相互作用可降低病毒转录水平及后续病毒产物水平。与靶蛋白融合的分裂荧光素酶的最佳片段必须预先确定。

在此情况下，将大片段（Large Bit）融合在HPX的C末端，将小片段（Small Bit）融合在DDB1的末端，获得了最佳结果。