通过活细胞中eIF4E-eIF4G相互作用的检测来监测eIF4F复合物的组装

eIF4F复合物信号转导的调控与参与癌症增殖和存活的mRNA亚群翻译增加相关。本文描述了一种基于细胞的eIF4E-eIF4G蛋白-蛋白相互作用检测方法，可使我们在活细胞中评估药物诱导的eIF4F复合物完整性的改变。目前，人们日益关注能够有效靶向蛋白-蛋白相互作用界面的干预手段的开发。

我们设想，本eIF4E-eIF4G PPI检测方法将有助于推动并验证这些策略。该检测方法将为eIF4E-eIF4G抑制剂的优化提供理想的初步筛选方案。正确接种细胞并进行转染操作是本产品中最关键的环节，因为这些步骤可能直接影响PPI报告系统的抑制效果。

解冻细胞并计数后，使用6孔板接种HEK 293细胞，每孔加入2毫升标准培养基。在第2天早晨，针对每次计划的转染，取9微升基于脂质体的溶液，加入含有125微升无酚红低血清培养基的离心管中进行稀释。在稀释后的脂质体于室温孵育5分钟的同时，准备DNA主混合液：针对每个转染管，将3微克的每种质粒溶解于125微升低血清培养基中。

向DNA主混合液2中加入12微升增强剂试剂，充分混匀。立即将该混合物以1:1的比例加入到每管稀释的脂质体中。室温孵育DNA-脂质复合物15分钟后，将复合物加入6孔板的每孔中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。第3天上午，用1毫升PBS洗涤每个孔，加入0.3毫升胰蛋白酶。将培养板在37摄氏度下孵育5分钟。

孵育后，通过向每孔加入2毫升不含酚红的低血清培养基来中和胰蛋白酶。将转染的细胞转移至15毫升离心管中。接着，在290×g条件下离心5分钟。

吸弃培养基，将细胞沉淀重悬于 2 毫升低血清培养基中。将转染的 HEK 293 细胞以每孔 30,000 个细胞的密度接种至 96 孔不透明板中，每孔加入 90 微升培养基。为在同一实验中对 3 种不同化合物各获得 3 个技术重复，共接种 60 孔。

排除边缘的孔。转染细胞接种后，立即向每孔加入10微升含10% DMSO的化合物溶液。通过将每种目标化合物溶解于100% DMSO中，配制1毫摩尔浓度的化合物储备液。

为了使每种化合物滴定具有3个重复，使用8微升的1毫摩尔化合物储备溶液。在96孔PCR板的8个孔中，通过移液将每种储备化合物溶液进行两倍系列稀释：在每个滴定点，将4微升的1毫摩尔储备液加入4微升的100% DMSO中。在完成两倍系列稀释的最后一个点后，弃去多余的4微升溶液。

向每支试管中加入 36 微升 HPLC 级无菌水，以制备 40 微升含 10% DMSO 的 10 倍化合物系列稀释溶液。同时制备一个对照，即在 HPLC 级无菌水中配制仅含 10% DMSO 的储备溶液。

向96孔不透明板中的细胞加入10微升10倍工作溶液，以达到预期的终浓度，同时保持残留DMSO浓度为1%。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育3小时。3小时后，通过将1份底物与19份稀释试剂混合，开始配制荧光素酶底物试剂。使用多通道移液器立即将25微升底物试剂加入含细胞的96孔板的每个孔中。

将培养板置于摇床中，350 RPM 振荡，室温孵育 50 分钟。为检测发光信号，将培养板放入酶标仪中。将仪器模式设置为发光检测，发射波长滤光片设为 455。

使用6.5毫米的检测高度，检测时间为1秒。为评估细胞活力，向每个孔中加入33微升活力检测试剂。室温孵育15分钟后，将酶标仪的镜面检测模式设为发光检测，发射滤光片设为600，测定发光信号。

采用6.5毫米的测量高度和1秒的测量时间。利用酶标仪的数据，通过将数据拟合到文稿中所述的四参数拟合曲线方程，确定每种化合物的IC50值。HEK 293细胞转染了eIF4E-eIF4G互补系统，随后进行复苏并用mTOR抑制剂处理。

在处理4小时后检测发光信号时，PP242和雷帕霉素均表现出剂量依赖性的信号抑制作用。PP242和雷帕霉素均未引起细胞活力的显著下降，表明eIF4E-eIF4G互补系统中发光信号的降低并非由非特异性细胞死亡所致，而是由于EIF4E-4G相互作用被阻断。m7GTP沉淀实验后的Western blot分析显示，4EBP1介导的内源性eIF4E-eIF4G相互作用的破坏与所测得的eIF4E-eIF4G检测信号变化一致。

PP242 对总4EBP1磷酸化的抑制作用强于雷帕霉素。两种抑制剂均能正常影响mTOR信号通路，其中雷帕霉素对mTORC1底物的抑制活性更强，而PP242则可同时靶向mTORC1和mTORC2。该实验最关键的操作步骤包括：在转染当天接种细胞，将细胞重新接种于无酚红培养基中，检测eIF4E-eIF4G互补实验的发光信号，并在同一块培养板上进行细胞活力检测。

可以进行二次活力检测，以评估任何靶向药物及其已知的特定效应。