用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜技术
2018年9月7日
采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。
该方法有助于回答生物学领域中的关键问题，即细胞膜内的生物蛋白质如何创造有利于生物复制和组装的环境。本方法结合了两个关键技术基石：第一，活细胞成像与电子显微镜技术的关联；第二，高压冷冻技术。尽管该方法最初是为研究病毒来源相互作用而设计并成功应用，但其可轻松推广至细胞生物学的多种应用场景。此方法的可视化演示至关重要，因为其中许多步骤的成功实施依赖于实际操作经验，尤其是高压冷冻的低温固定及其后续步骤。首先，将表面刻有字母数字图案的蓝宝石载片放入一个15毫升的圆锥形离心管中，并用乙醇彻底清洗这些载片。将清洗后的蓝宝石载片置于铺有滤纸的培养皿中晾干，然后使用细长镊子将干燥后的蓝宝石载片转移至载玻片上。在4倍放大倍数的倒置显微镜下，确认每一片蓝宝石载片上的坐标图案清晰可读。随后，使用紫外交联仪对载片进行五分钟的灭菌处理。在生物安全柜中，向细胞培养皿中加入一半体积的细胞培养基，并用长镊子小心地将蓝宝石载片转移至培养皿中。接着，接种1×10
概述
本文介绍了一种相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），用于可视化病毒诱导的细胞内结构。通过整合光学显微镜（LM）与电子显微镜（EM），研究人员能够深入理解病毒与宿主之间的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜技术
- 病毒-宿主相互作用
背景
- 该方法结合了活细胞成像与电子显微镜技术。
- 高压冷冻是该技术的关键组成部分。
- 该方法已成功应用于病毒相互作用的研究。
- 该方法可推广至细胞生物学的多种应用中。
研究目的
- 观察病毒感染在细胞内诱导的结构变化。
- 加深对细胞膜中生物蛋白相互作用的理解。
- 为使用该方法的研究人员提供实用操作指南。
使用的方法
- 为成像准备图案化蓝宝石圆片。
- 使用倒置显微镜确认图案。
- 采用紫外交联对圆片进行灭菌。
- 细胞培养技术将细胞接种到蓝宝石圆片上。
主要结果
- 成功可视化病毒诱导的细胞内结构。
- 展示了联用光镜与电镜（CLEM）在研究病毒-宿主相互作用中的有效性。
- 概述了实施该方法的具体操作步骤。
- 在更广泛的细胞生物学领域中的潜在应用。
结论
- CLEM 方法为病毒生物学提供了宝贵的见解。
- 它弥合了光学显微镜与电子显微镜之间的差距。
- 鼓励在细胞生物学中进一步应用该方法。
常见问题
执行层面的行业相关性
相关联的光镜与电镜技术（Correlative Light Electron Microscopy, CLEM）通过实现对稀有转染或感染细胞群体的靶向分析，解决了病毒学研究中的一个关键瓶颈问题。该方法结合基于荧光的活细胞成像与通过高压冷冻实现的高分辨率超微结构保存，从而提高了病毒-宿主相互作用机制研究中的预测可信度。通过提供将功能表型与亚细胞结构相关联的整合数据，该技术有助于在抗病毒药物发现流程中进行早期靶点验证和检测方法开发，支持“推进/终止”决策的制定。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将荧光标记的病毒蛋白表达与冷冻固定细胞中的超微结构变化相关联，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过光学显微镜进行预筛选，提高研究转染或感染效率较低事件的效率。
- 预测价值：通过可视化病毒诱导的膜结构改变及与复制复合体相关的组装位点，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成相关的荧光和电子密度读数，能够对病毒蛋白的定位及结构扰动进行定量评估。
- 操作价值：采用图案化蓝宝石圆片标准化样品制备流程，有助于在不同实验和操作者之间实现可重复的关联分析。
- 检测适用性：产生超微结构保存良好的样品，适用于筛选项目中的下游成像和形态计量分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：从活细胞成像到电子显微镜保持结构保真度，支持在与疾病相关的系统中进行生物标志物对齐的表型筛选。
- 临床前建模：能够在接近天然状态下详细表征病毒诱导的细胞病变效应，提高转化外推的可信度。
- 风险调整的推进：提供超微结构证据，以支持或排除抗病毒候选药物的作用机制。
流程与工作流整合
关联光电子显微技术（CLEM）贯穿了从早期病毒学研究中的假设生成到先导化合物优化阶段的机制验证这一发现过程，尤其在需要蛋白质功能的结构关联信息时具有重要意义。
- 发现生物学：通过直接可视化特定细胞亚群中病毒蛋白相关结构，支持假设验证。
- 筛选：通过标准化的细胞定位和冷冻保存，提高检测的可靠性，减少结构读数的变异性。
- 分析：提供关联的光学与电子显微镜数据集，可基于荧光强度和超微结构特征对不同条件进行定量比较。
- 转化研究：将功能成像与高分辨率结构数据相结合，支持从基于细胞的检测到机制验证的连续性研究。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的平台，用于研究适用于多种靶标和病毒家族的病毒-宿主相互作用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供病毒蛋白定位及诱导结构变化的直接相关证据，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化使用图案化基底和高压冷冻技术，减少化学固定带来的假象，提高实验可重复性。
- 战略价值：在超微结构水平上验证靶点结合，为“继续/终止”决策提供依据，降低后期研发失败风险。
- 项目组合影响：基于对抗病毒候选药物在病毒复制区室或组装位点上确切效应的确认，实现风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备活细胞荧光成像、高压冷冻、冷冻置换和透射电子显微镜方面的专业技术。
- 依赖于高压冷冻仪、超薄切片机以及光镜与电镜联用成像系统的可用性。
- 需要在不同研究团队之间统一标记物（例如，图案化蓝宝石圆盘）和坐标映射方案的标准化。
- 针对不同细胞类型或病毒系统的应用，可能需要优化转染效率、荧光标记和冷冻参数。
- 实际限制包括由于使用专用设备导致通量较低，以及需要进行软件辅助的关联图像对齐，如原始文献所述。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
