一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

双功能钛固定化金属亲和色谱策略可在同一实验流程中同时富集N-糖肽和磷酸化肽，从而在同一次分析中增加生物分子信息量。该富集方法的主要优势在于具备两种分离机制，能够将N-糖肽和磷酸化肽分别在不同组分中实现同步分离，以便进行后续质谱分析。采用此富集方法可提高对胰腺组织等复杂生物样品中糖基化和磷酸化修饰的检测能力，有助于发现糖尿病和癌症等疾病的生物标志物。

由于该方法依赖于离心柱尖端和离心步骤，因此必须控制离心速度，并确保样品中无任何颗粒物，以防止堵塞。首先，将组织研磨器中与胰腺组织接触的部件（包括研磨室、研磨头和回收勺）以及所有刮勺，在聚苯乙烯容器中预冷。接着，将组织块转移至预冷的样品 holder 中，并向组织中加入液氮，直至完全冻结。

将研磨器放入研磨腔后，用锤子敲击5到10次以粉碎样品，随后将研磨器从研磨腔中取出，并刮下附着在研磨器上的组织粉末和碎片。接着，若组织开始融化，向研磨腔中加入一勺液氮，并重复研磨过程，直至获得细粉状样品，然后将样品分装至预冷的离心管中，每管约100毫克。配制裂解缓冲液后，将一片蛋白酶抑制剂和一片磷酸酶抑制剂分别溶于500 µL水中，配制成浓度为所需终浓度20倍的储备液，并根据需要将适量的每种抑制剂储备液加入裂解缓冲液中，以达到最终的抑制剂浓度。

向离心管中加入 600 微升裂解缓冲液后，置于加热金属块中，在 95 摄氏度下孵育 10 分钟，同时以 800 转/分钟振荡，随后将样品从加热金属块中取出，使其冷却至室温。接下来，以 60 瓦功率对样品进行超声处理，总时长 45 秒，采用 15 秒脉冲，脉冲间间隔 30 秒，然后在 4 摄氏度下以 3000 × g 离心 15 分钟，使样品沉淀。将上清液加入到其体积五倍的沉淀溶剂中。

例如，将300 µL裂解缓冲液加入含有50%丙酮、49.9%乙醇和0.1%乙酸的1.5 mL沉淀溶剂中，然后在80°C下冷藏过夜。在4°C条件下，以3000 × g离心15分钟再次收集样品沉淀，并移除上清液；随后用刮勺打散沉淀，加入等体积的沉淀溶剂重悬洗涤。再次离心后，将样品沉淀置于通风橱中风干15分钟，随后于80°C保存，直至准备进行下一步操作。

首先，将蛋白质沉淀重悬于 300 微升新配制的消化缓冲液中，该缓冲液含有 50 毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液和 8 摩尔尿素。向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇，使其终浓度为 5 毫摩尔，混匀后于室温还原 1 小时；然后加入碘乙酰胺，使其终浓度为 15 毫摩尔，混匀后避光于室温烷基化 30 分钟。

接下来，按照1:100的酶与蛋白质比例加入Lys-C/胰蛋白酶，在37摄氏度培养箱中孵育4小时，然后加入50毫摩尔的三乙基碳酸氢铵缓冲液，将所用的8摩尔尿素稀释至低于1摩尔。按照1:100的酶与蛋白质比例加入胰蛋白酶后，在37摄氏度培养箱中过夜孵育，随后通过加入三氟乙酸终止消化反应。每1毫克起始蛋白质，使用1毫升乙腈对脱盐柱进行预处理，并用1毫升0.1%三氟乙酸冲洗三次，然后将消化后的混合物加载到脱盐柱上，并用1毫升0.1%三氟乙酸洗涤三次。

接下来，使用一毫升含60%乙腈和0.1%甲酸的溶液洗脱肽段，然后在约35摄氏度下使用离心真空浓缩仪将洗脱的肽段干燥，直至溶剂完全蒸发。将肽段重新悬浮于水中后，根据制造商的说明书，采用肽定量检测试剂盒测定肽段浓度，随后将肽段分装为每份500微克的等分试样，并彻底干燥。称取约三毫克脱脂棉，填充至一个空的自旋尖端柱中。

将一克固定化金属亲和层析钛材料转移至离心管后，加入0.1%三氟乙酸，调节至已知浓度。向离心柱尖端加入足够量的浆液，以转移20毫克材料，随后用200微升0.1%三氟乙酸通过离心洗涤离心柱尖端。将样品重新悬浮于200微升上样/洗涤溶剂中，并使其流过离心柱尖端。

用上样/洗涤溶剂通过离心洗涤自旋柱尖端后，再用200微升含0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗涤自旋柱尖端，然后分别用200微升E1和E2溶液洗脱肽段，并分别分析每次洗脱液。使用E3和E4溶剂重复洗脱过程，并在下游分析前合并相应的洗脱组分。在进行碱性pH条件下的洗脱前，先用200微升含2.5%氢氧化铵的90%乙腈溶液对材料进行三次预处理，然后分别用200微升E5和E6溶剂洗脱肽段，洗脱后通过填充柱脱盐，并分别分析各洗脱液。

接下来，用200微升不同浓度的乙腈和氢氧化铵溶液洗脱肽段。随后，合并这些洗脱液，并在使用填充尖端进行脱盐后，作为单一样品E7进行分析。通过数据库搜索软件鉴定，获得了来自N-糖基化和磷酸化肽段的注释明确的高置信度MS/MS谱图，这些谱图显示出前体离子丰富的碎片信号，从而提高了鉴定结果的可信度。

通过使用双功能钛固定化金属亲和色谱离心柱方法对各洗脱组分进行富集后，从样品中鉴定出肽段。大多数糖肽在前四个组分中洗脱，而大多数磷酸化肽在最后三个组分中洗脱，从而减少了电离过程中的潜在干扰。将双钛方法获得的糖蛋白质组学结果与仅富集Ehrlich糖肽的方法进行比较，结果显示，在根据糖链组成分为六类后，两种方法中各类糖链的比例相似。

将双钛法的磷酸化蛋白质组学结果与传统的仅富集磷酸化肽段的固定化金属亲和层析法，或两种方法联合使用的结果进行了比较。大多数磷酸化氨基酸被鉴定为丝氨酸和苏氨酸，约有1%为磷酸化酪氨酸。正确构建离心柱尖端对于确保洗脱过程顺利进行至关重要。

将棉塞紧密地插入尖端，以便富集材料可以置于棉塞之上。我们已采用双功能钛离子亲和层析（IMAC）方法，用于对大多数组织及 SARS-CoV-2 刺突蛋白中的糖基化和磷酸化进行同步表征。