一种快速定量的翻译后修饰与变异支持型肽段基因组定位方法

本软件方案的总体目标是演示如何使用 PoGo 将来自质谱实验的带有相关翻译后修饰和定量信息的肽段映射到参考基因组上，并实现与正交基因组学数据的整合与可视化。该工具可帮助向质谱蛋白质组学搜索生成的肽段列表中添加基因组信息，从而促进其与RNA测序数据的整合。该工具的主要优势在于操作简便、运行快速，并支持翻译后修饰、定量信息以及氨基酸变异等附加信息。

首先，根据随附文本方案中所述的方法，下载并安装本视频中演示的软件。安装完成后，导航至 PoGo GUI 可执行文件夹，通过双击 PoGo GUI 图标启动程序。点击 PoGo 可执行文件旁的选择按钮进行操作。

然后进入可执行文件文件夹，导航至相应操作系统的子文件夹，并选择可执行的 PoGo 文件。通过点击“打开”按钮确认选择。接下来，点击“选择”以选定用于蛋白质序列的参考输入文件。

导航至数据文件夹并选择翻译快速日文件。通过点击“打开”确认选择。使用选择按钮选中转录注释文件。

然后导航至数据文件夹，选择注释GTF文件并点击打开。使用肽段鉴定文件旁边的“添加”按钮来添加肽段鉴定文件。在此处，选择支持的格式文件，如 MZ Tab、MZ Ident ML 或 MZ ID 格式，或制表符分隔的四列格式文件。

此外，在输出格式选择中，取消勾选 BED NGTF 旁边的复选框，仅保留 PTM BED 和 GCT 处于勾选状态。然后从下拉菜单中选择数据对应的物种，并点击“开始”以启动映射。

首先，将 PoGo 输出文件（以 _ptm.bed 结尾）加载到整合基因组浏览器中。重复操作，同时加载以 _noptm.bed 结尾的文件。

此文件包含所有未经过任何修饰的肽段。通过将轨道拖放到列表中的目标位置来重新排序。每个文件将显示为独立的轨道，并以文件名标识该轨道。

每条轨迹最初均以折叠形式显示。要展开它们，请右键点击轨迹名称并选择“展开”，以完整查看包括序列在内的肽段信息。现在加载以 gct 结尾的文件。

此文件包含肽段定量信息。与之前加载的文件不同，每个已注释的样本将作为独立的轨道加载。可通过拖放操作按需重新排列样本。

通过在下拉菜单中选择染色体、单击并按住染色体的某一片段以放大，或输入基因组坐标来浏览基因组。PoGo比对可通过图形用户界面或命令行界面进行。在本实验方案部分，使用命令行界面以突出其可互换性。

为了将通过前述文本方案步骤获得的变异肽段比对到参考基因组，打开命令提示符并导航至 PoGo 的可执行文件文件夹。然后输入此处所示的命令。按回车键确认执行，并等待执行完成后再继续后续操作。

在整合基因组学浏览器中可视化无错配和有错配的肽段比对结果。在 PoGo 图形用户界面软件中，通过点击肽段文件旁边的“添加”按钮来添加肽段鉴定文件，并选择单个或多个文件，也可直接拖拽至肽段文件下方的空白区域。然后，在输出格式部分取消勾选 PTM BED、GTF 和 GCT 旁边的复选框，仅保留 BED 处于勾选状态。

此外，选择将多个输入文件合并为单个输出文件的选项。这将生成一个包含所有输入文件中肽段的单一输出文件。若不选择此选项，则程序将针对每个输入文件依次单独执行。

接下来，从下拉菜单中选择与快速日 NGTF 文件一致的数据对应物种。选择后，单击开始按钮以启动比对。为了从比对后的肽段生成 track hub，请打开终端窗口，并在命令提示符中输入以下命令。

按回车键确认执行。执行过程只需很短时间即可完成。完成后，将生成的 track hub 及其所有内容传输至可通过网络访问的 FTP 服务器或 GitHub 上。

在网页浏览器中，访问 UCSC 基因组浏览器，选择“我的数据轨道中心”（My Data Track Hubs），然后点击“我的中心”（My Hubs）选项卡。将轨道中心的 URL 复制到文本框中，然后单击“添加中心”（add hub）以加载该轨道中心。

最后，选择基因组浏览器以进入浏览视图。自定义轨迹集线器将显示在列表顶部。如果该轨迹集线器基于多个 BED 文件构建，则每个文件将在集线器内显示为独立的轨迹。

此处比较了PoGo与另外两种蛋白质基因组学比对工具在总体内存使用和分析运行时间方面的表现。PoGo在速度和内存使用方面均显著优于其他工具，并且能够将肽段相关的翻译后修饰和定量信息映射到基因组上。PoGo利用着色选项，为肽段在基因组内比对的唯一性提供直观的视觉辅助。

红色映射表示唯一对应于单个转录本的肽段，而方块高亮表示映射到单个基因的肽段。灰色映射表示在多个基因之间共享的肽段。PoGo 的 PTM BED 选项重新定义了颜色编码，以容纳不同类型的翻译后修饰，并在发生修饰的氨基酸残基位置用粗块标示修饰的位置。

在此处展示的结直肠癌蛋白质组数据中，仅鉴定出两条肽段，每条肽段均显示单个磷酸化位点。输出的 GCT 文件中的信息提供了由肽段覆盖的基因组区域的定量数值。跨越剪接位点的肽段被分割为其组成部分，且各部分之间不进行连接。

关于剪接的更全面信息，还需要输出的 GTF 文件。一旦下载并设置好参考蛋白序列和注释，在不允许序列错配的情况下，可在五分钟内将数千个肽段映射到基因组坐标上。使用 PoGo 将肽段映射到参考基因组时，务必记住要使用蛋白质编码转录本的翻译序列及其相关的转录本注释。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 PoGo 和 PoGo GUI 将蛋白质组学质谱实验中获得的肽段及其相关联的信息映射到参考基因组上，并对其进行可视化展示。