在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

该方案可从人多能干细胞中诱导获得交感神经元。这些细胞将使科研人员能够研究影响人类交感神经系统的疾病。该技术可在无饲养层、分隔培养条件下高效地大规模诱导交感神经元。

在20天内可获得具有电生理活性的神经元。该技术可应用于由交感神经系统功能障碍引起的疾病，也可用于疾病建模、再生医学以及药物筛选。这些细胞可在体外共培养系统中用于创新性地研究任何组织，例如用于心脏组织调控的研究。

当人多能干细胞培养达到 80% 至 90% 汇合度时，应观察到具有光滑明亮边缘的大克隆。传代时，先用 PBS 洗涤培养物，然后在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下，加入 4 毫升 0.25 摩尔的 EDTA 处理细胞。两分钟后，用 10 毫升 E8 培养基冲洗培养皿，并将脱落的细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中。

然后将500 µL细胞转移至含有9.5 mL新鲜E8培养基的分装管中。将干细胞接种到新的经玻连蛋白包被的100 mm培养皿中。在诱导分化前一天，用基底膜基质对适量的6孔板进行包被，每孔加入2 mL基底膜基质。

将培养板在4°C下过夜保存。次日早晨，将培养板恢复至室温，并用新鲜的PBS洗涤即将分裂的人多能干细胞培养物，每次洗涤使用新鲜PBS，共洗涤两次。第二次洗涤后，在细胞培养箱中用7毫升0.5毫摩尔EDTA处理15分钟，随后吸出悬浮的人多能干细胞，并将收集的细胞转移至50毫升离心管中。

向离心管中加入等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），以稀释EDTA，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升第01天分化培养基中，然后加入适量培养基进行计数。将细胞稀释至每平方厘米1.25 × 10⁵个细胞的浓度，加入适量分化培养基至每孔所需体积。

从先前准备好的六孔板的每个孔中吸除所有基底膜基质溶液。然后向每个孔中接种2毫升细胞，并将该板放入细胞培养箱中。次日早晨，每孔加入3毫升第01天分化培养基对细胞进行换液。

在分化第二天，每孔加入三毫升分化第2至第10天培养基对细胞进行换液，之后每隔一天换液一次，直至第10天。为将神经嵴细胞聚集成球状体，于第10天用PBS洗涤细胞，并向每孔加入两毫升解离培养基。

在细胞培养孵育箱中孵育20分钟后，将悬浮细胞转移至一个50毫升锥形管中，并用新鲜PBS将管内悬液体积补至50毫升。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量的第10至14天类球体培养基中，用于细胞计数。

计数后，用第10至14天的类球体培养基将细胞稀释至每500微升含5×10⁵个细胞的浓度。将500微升细胞悬液接种至超低吸附24孔板的每个孔中。然后将细胞放回细胞培养孵育箱中。

为了诱导形成最小类球体培养，在培养的第11天，向每孔中额外加入500微升第10至14天的类球体培养基，以喂养神经嵴类球体。在第12天，倾斜培养板，使类球体聚集在培养板的一侧，并小心吸除各孔中尽可能多的培养基，注意不要吸走类球体。

随后，每孔加入1毫升第10至14天的类球体培养基对类球体进行换液。为了诱导形成扩增的类球体培养，在第15天时，每孔加入1.5毫升第10至14天的类球体培养基，并补充0.5 µM视黄酸。然后将类球体放回细胞培养孵育箱中。

对于交感神经元分化，在第14天或第28天，倾斜培养板使类球体聚集到培养板的一侧，并小心吸除尽可能多的培养基。加入一毫升交感神经元培养基喂养细胞。为将较大的类球体聚集体分散成较小的类球体，每孔加入不超过一毫升的培养基，吹打5至10次后再进行分瓶。

去除先前准备的24孔板中多余的层粘连蛋白和纤连蛋白。将24孔球体培养板中每个孔的1毫升球体悬液分装到新包被的24孔板的四个独立孔中。每孔加入250微升新鲜的交感神经元培养基。

将培养板放入细胞培养箱中。次日早晨，将每孔中的培养基更换为1 mL添加了0.125 µM视黄酸的交感神经元培养基，并将培养板放回细胞培养箱。第35天后，通过小心更换每孔中一半的原有培养基为新鲜培养基来喂养神经元。

分化前，人多能干细胞集落应呈圆形，边缘光亮、平滑，且几乎无分化迹象。自第4天至第10天，细胞表达神经嵴标志物Sox10。自第6天起，可见密集、深染的神经嵴细胞呈脊状隆起。

这些脊状结构也表达 Sox10。在神经嵴细胞阶段，Sox10 与细胞表面标志物 CD49D 存在共表达，后者可用于分选神经嵴细胞。经分选的阳性细胞群体与未分选细胞群体均能以相似的方式形成神经嵴类球体。

尽管经阴性分选的细胞无法正常聚集，不能形成圆形、表面光滑且形态健康的类球体，并在三到四天内死亡。此外，当在第14天比较神经嵴类球体时，定量逆转录PCR检测神经嵴及交感神经前体标志物的结果显示，分选细胞与未分选细胞之间无显著差异。在第20天或第35天，根据相应的最简或延长方案，可观察到神经样细胞从贴壁的类球体呈放射状生长。

在此阶段，与去甲肾上腺素合成和转运相关的标志物以及 Hox6 至 Hox9 躯干神经嵴基因均有表达。自第20天起，电生理记录亦可检测到神经活动。通过作用于交感神经元自受体的药物可增强或抑制此类活动，从而调节已分化神经元的功能。

人源前体细胞本身必须从分化第0天起保持健康状态，否则实验很可能会失败。可通过向神经元添加药理学抑制剂或激活剂，以研究其正常或病理状态下的行为。该方法为研究交感神经系统的生物学与病理学开辟了新的途径，因为现在已能够轻松地从人体获取交感神经元活检样本。