样品制备 原位 哺乳动物细胞的冷冻断层扫描技术

本研究的目标是建立一种既易于实现又可靠可重复的样品制备方法。通过实现这一目标，可以直接利用细胞原位冷冻电子断层成像技术来回答多种多样的生物学问题。然而，载网样品制备面临诸多挑战。

细胞不易附着于载网上，操作过程可能导致碳膜层受损，从而造成可用于成像的载网区域丢失。此外，若不注意适当的样品制备条件，细胞细长突起的出现频率会降低。目前的实验方案通常需要使用特殊设备来解决接种过程中的主要瓶颈问题，例如采用微图案化技术以及3D打印的细胞附着与操作支架。

本方案在保持这些专用工具可用于下游应用的灵活性的同时，提供了更便捷的解决方案。开始准备用于细胞冷冻断层扫描的电子显微镜载网时，将带有穿孔碳支持膜的载网放入辉光放电仪中，使载网的碳膜面朝上。随后在0.39毫巴的大气压下以15毫安的电流对载网进行45秒的辉光放电处理。

完成后，将网格置于内衬滤纸的洁净容器中。接着，将网格连同纤连蛋白、磷酸盐缓冲液（PBS）、培养板和镊子一起转移至生物安全柜中。使用微量移液器，在无菌表面（如六孔板盖）上滴加两滴足量的牛纤连蛋白溶液。

确保液滴足够大，能够完全覆盖整个载网。然后取 5/15 镊子，用纤连蛋白黏附溶液处理载网的两侧。经牛纤连蛋白处理后，载网将变得具有黏性。

用镊子轻轻将网格的非碳表面接触六孔板中空孔的底部，然后松开镊子，使网格附着于新表面。接着，将网格在纤连蛋白黏附溶液中孵育30分钟。为防止网格干燥，每隔15分钟使用微量移液器在网格上方添加一至两滴黏附溶液。孵育结束后，用微量移液器吸除多余的黏附溶液。

使用微量移液器将PBS液滴直接滴加到载网上，清洗2至3次。将载网置于生物安全柜内的紫外灯下照射一小时以进行灭菌。为达到最佳灭菌效果，应将载网放置在尽可能靠近紫外灯的位置。

在灭菌过程中，每隔10分钟用微量移液器在网格表面滴加一至两滴PBS，以防止网格干燥。开始接种细胞前，使用机械或酶法解离细胞后进行细胞计数。用微量移液器将计算好的细胞数量加入六孔板的各孔中，六孔板内应已预先放置好用于电子显微镜的网格，并注意避免产生气泡。

确保每孔细胞悬液维持在1.5至2.0毫升。转染HIV分子克隆时，将细胞在37摄氏度孵育16至24小时。向一个洁净的微量离心管中加入50微升无血清DMEM和1微克DNA。

每个孔分别取三微升转染试剂，加入无血清DMEM培养基中，置于单独的洁净微量离心管内。使用微量移液器分别混匀各管。然后通过微量移液器将转染试剂混合物加入DNA混合物中，室温孵育15分钟。

随后，将100微升转染试剂与DNA混合物逐滴加入每个孔中，直接滴加在网格上方。转染后16至24小时更换培养基。共转染24小时后，相差显微镜和荧光显微镜观察显示，所有网格的碳层均仅有轻微撕裂。

在阴性对照载网和共转染载网上，多个网格区域均含有活细胞。在将含有细胞的透射电镜载网进行冷冻固定之前，需在倒置光学显微镜下检查载网，记录每张载网上的细胞密度，以调整冷冻固定过程中的滤纸吸附时间。

在空培养皿中将两到三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）于37摄氏度预热。制备金标记物时，取50微升10纳米胶体金珠溶液，移入洁净的1.5毫升离心管中，加入2微升牛血清白蛋白，通过反复移液混匀。

将离心管在15,000至20,000 g下离心15分钟。使用微量移液器小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。用50 µL PBS重悬沉淀，并按前述方法再次离心。

用10微升枪头吸取4微升沉淀，并转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。将环境培养箱设置为95%湿度和30摄氏度。使用5/15镊子选取一个载网，并用PBS洗涤。

将洗涤后的载网转移至冷冻夹中。固定好载网后，取下5/15镊子，并滑动固定冷冻夹上的夹子。在保持夹子固定的同时，将载网插入冷冻仪中。

向载网的背面加入一微升金标。然后向载网的碳膜面加入二至三微升磷酸盐缓冲液（PBS）。利用自动 blotting 装置对载网背面进行 blotting 处理，随后将载网浸入液态乙烷中快速冷冻。

转染的 U-2 OS 细胞的冷冻关联光镜与电镜图像揭示了可产生 HIV 的细胞的存在。冷冻电子断层扫描图像显示多个 HIV 颗粒从 U-2 OS 细胞的质膜上出芽。