用于研究B淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

该方法可实现对B细胞在免疫突触处施加的力的空间-时间分布进行测量，并将其与特定蛋白质的募集相关联。使用聚丙烯酰胺凝胶进行牵引力显微镜检测易于实施。本方案可用于快速建立对大量B细胞机械能力的测量。

该方法具有灵活性，可适用于绘制其他配体（如整合素）的图像，或用于研究其他类型的免疫突触，例如T细胞或受阻的吞噬作用。由于本实验所需的凝胶具有特定的物理和化学性质，将经典的牵引力显微镜技术应用于B细胞可能存在一定难度。首先对凝胶载体进行硅烷化处理。

使用紫外灯对盖玻片或玻璃底培养皿活化两分钟，然后加入200微升APTMS处理五分钟，以使载体表面硅烷化，为凝胶的共价结合做好准备。随后用超纯水彻底清洗盖玻片或玻璃底培养皿，并通过真空抽吸干燥。

为准备用于压平凝胶的盖玻片，将盖玻片放入陶瓷盖玻片架中，将架放入一个小烧杯内，倒入硅化试剂，确保完全覆盖盖玻片。用铝箔覆盖烧杯，在室温下静置三分钟。同时，用超纯水注满一个大烧杯。

在硅化试剂中孵育3分钟后，将带有盖玻片的盖玻片架转移至盛有水的烧杯中。用超纯水彻底冲洗盖玻片。充分干燥后，将其放置在擦镜纸上。

为获得最佳结果，应立即进行凝胶聚合。根据手稿说明制备500帕斯卡的凝胶预混液，然后将167微升预混液与1.67微升微珠混合。将混合物在水浴超声仪中涡旋并超声处理五分钟。

用铝箔遮光以保护混合液。为促进聚合，在凝胶混合液中加入 1.67 µL 的 10% 过硫酸铵，然后加入 0.2 µL TEMED 并用移液器混匀，以启动聚合反应。浇注凝胶时，将 9 µL 凝胶混合液移取到每张硅化盖玻片或玻璃底培养皿上。

立即用硅化盖玻片压平凝胶，并用镊子用力按压，确保凝胶铺满盖玻片的整个区域，并有部分溢出。将盖玻片或玻璃底培养皿倒置放入一个大的培养皿中，并轻敲实验台，使微珠向凝胶表面聚集。在培养皿内放置湿润的纸巾，以形成湿润的孵育环境。

用铝箔覆盖，孵育一小时。孵育结束后，向样品中加入 PBS 以促进盖玻片脱落。用针小心移除盖玻片，轻微倾斜培养皿，但确保凝胶始终浸没在 PBS 中。

硅化试剂、丙烯酰胺、碱性丙烯酰胺和 TEMED 通过吸入可能具有毒性。请佩戴标准个人防护装备，并在通风橱中操作这些试剂。从凝胶中吸除 PBS，然后在室温下加入 150 微升 Sulfo-SANPAH。

将凝胶暴露于紫外线下处理两分钟，然后用 PBS 洗涤凝胶三次。重复使用 Sulfo-SANPAH 处理并用 PBS 洗涤三次，随后向凝胶中加入 250 µL 鸡蛋溶菌酶（hen egg lysozyme 或 HEL），在湿度 chamber 中，4 °C 条件下避光（铝箔覆盖）孵育过夜。孵育结束后，移除 HEL 抗原，并用 PBS 洗涤凝胶三次。

最后，加入500微升B细胞培养基覆盖凝胶，并在室温下静置。使用带有温度和二氧化碳控制功能的共聚焦显微镜进行成像。吸除凝胶中的培养基，保留约200微升。

将凝胶放置在显微镜上。在凝胶的底部和顶部会出现两层主要的微珠。聚焦于凝胶平面，并找到一个均匀的区域进行成像。

仔细选择成像区域，并确保始终保持对焦。合适的微球密度和平整的表面是获得稳定且可靠力测量结果的关键。向凝胶中加入 80 微升来自 MD4 小鼠的初始 B 淋巴细胞，注意避免触碰凝胶以维持对焦状态。

确保焦点仍然正确，并且可以在该区域观察到细胞下沉。在细胞到达凝胶之前启动采集。在 ImageJ 中将视频作为图像堆栈打开，然后运行宏 cropandsave.ijm。

选择输出目录并配置属性通道设置。使用矩形工具选择感兴趣区域，并通过按 T 键将其添加到 ROI 列表中。完成后，单击“确定”。当宏生成细胞的掩膜时，如果结果满意，则单击“确定”。

若结果不理想，请点击“不 OK”，然后使用任意选择工具手动选择一个闭合区域，再点击继续。打开 MATLAB 并运行 tfmv1.m，输入所需参数。

具体而言，需检查图像属性，例如像素大小和采集时间间隔，以及凝胶属性，例如杨氏模量 E 和泊松比。完成后，在原始文件所在的同一目录中查找软件输出结果。校正后的微珠图像应呈现均匀且随机分布的亮点，类似于繁星密布的夜空。

当微珠数量过少或图像失焦时，数据和分析结果不可靠。可通过使用细胞与基底首次接触之前的参考帧，目视观察微珠的运动。单颗粒追踪可获得近似结果。

该分析提供了参考图像中微珠的分割结果，作为对照。通过软件，还可以获得位移场和应力场，即每个像素点和每个时间点的局部应力矢量。将位移场与力场进行点积，并在细胞面积上积分，可得到细胞对基底所做的总功。

在比较两种生物学条件时，可计算能量达到平台期时最后几个时间点的平均曲线或平均值。当力的空间信息具有重要意义时，也可比较每种条件下的单个时间点。此处展示了一个荧光抗原提取的时间序列示例。

突触处荧光信号的逐渐出现表明抗原从凝胶上解离。荧光数据可用于构建平均提取曲线。该实验方案中最关键的步骤是在盖玻片下进行凝胶的聚合。

此步骤必须快速且小心地进行，确保凝胶在盖玻片下被均匀挤压。完成该操作后，可利用表达荧光蛋白的B淋巴细胞同时评估细胞内结构的定位和力的分布模式。该技术可与基因或化学干扰方法结合使用，以研究特定蛋白质在细胞收缩性和抗原摄取中的作用。