TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

本方案的主要优势在于降低了标记成本，提高了蛋白质提取效率，并可生成高质量的数据。我们方案的主要优点包括对不同类型样品的高标记效率、良好的可重复性以及可靠的数据获取能力。根据经IACUC批准的方案，从安乐死小鼠中分离出股四头肌组织样品后，称取10毫克肌肉组织，使用镊子分离肌纤维。

为了制备裂解液，将分离的组织样本转移至含有200微升1毫米氧化锆-硅珠和500微升CHAPS裂解缓冲液的2毫升离心管中。将样本放入珠磨破碎仪中，连续进行两次每次45秒的破碎程序。第二次循环结束后，为释放与DNA结合的蛋白质，将样本在冰上以50%的振幅进行10次超声处理，每次超声10秒，两次超声之间间隔30秒。

最后一次超声处理后，离心裂解液并将上清液转移至新的离心管中。进行还原/烷基化试剂处理时，将每种条件下 200 微克的蛋白质转移至新的离心管中，并使用新鲜的 CHAPS 裂解缓冲液将每管的终体积调至 100 微升。接着，向每管中加入 5 微升 TCEP，并将样品在 55 摄氏度下孵育 1 小时。

孵育结束后，将9毫克碘乙酰胺溶解于132微升100毫摩尔/升TEAB溶液中，并避光保存，得到375毫摩尔/升碘乙酰胺溶液。然后向每个样品中加入5微升碘乙酰胺溶液，室温下避光孵育30分钟。进行甲醇/氯仿沉淀时，向每100微升蛋白质样品中加入400微升甲醇，并短暂涡旋混匀样品。

为使附着在样品管壁上的液体进入管底，短暂离心样品，然后向每根试管中加入100 µL氯仿。短暂涡旋振荡后，迅速再次离心试管，使管壁上的液体收集至管底，随后向样品中加入300 µL水。剧烈涡旋以获得均一溶液，并在相同的离心条件下离心样品1分钟。

离心结束后，小心将离心管转移至试管架中，避免扰动各层，然后小心移除上清液。向剩余的中间层和底层加入 300 微升甲醇，并再次剧烈涡旋振荡样品。将样品离心 2 分钟，然后小心吸走上清液。

然后在气流下轻轻吸出各样本中尽可能多的液体，直至沉淀物略显湿润。每2分钟评估一次水合状态，持续约10分钟。如有需要，沉淀物可在-80摄氏度条件下保存，直至进一步处理。

为了消化蛋白质，将沉淀的蛋白沉淀物重悬于100微升TEAB裂解缓冲液中，并向100微克胰蛋白酶玻璃小瓶底部加入100微升胰蛋白酶储存溶液。室温放置5分钟后，每100微克蛋白质样品中加入2.5微升新配制的胰蛋白酶溶液，37摄氏度孵育过夜。进行肽段标记时，每支0.8毫克TMT标签小瓶用41微升无水乙腈溶解，室温下偶尔涡旋振荡孵育5分钟，同时避免标签暴露于光线下。

孵育结束后，短暂离心小瓶，然后小心地向每个100 µL样品中加入41 µL的TMT标记试剂，在室温下继续孵育1小时。孵育结束后，加入8 µL的5%羟胺溶液，在室温下反应15分钟以终止反应。随后将样品等分至新的离心管中，于-80°C保存。

在此代表性数据收集中，共分析了 39,653 种总肽段，其中 4,457 种含有两个或更多独特肽段，3,829 种包含所有通道的报告离子。采用倍数变化阈值来确定疾病细胞相对于健康细胞中蛋白质的相对分布，观察到 296 种蛋白质丰度显著降低，108 种蛋白质丰度显著升高。PANTHER 分析根据分子功能，对疾病细胞中丰度显著降低或升高的蛋白质进行了分类列表。

对丰度显著升高或降低的蛋白质进行串珠分析，进一步鉴定了多种蛋白质间的相互作用及其紧密关联。还可采用其他方法来鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，按类别对这些相互作用进行分类，并在多种信号通路中识别这些相互作用。蛋白质组学技术作为生物医学研究领域中的有力工具，通过提供详细的蛋白质丰度信息，有助于深入理解疾病发生发展的分子机制。